B8.6 TLC
Sæt en prik med sort tusch på et kaffefilter, og dyp kanten i vand. Vandet suges op gennem papiret, og den sorte prik bliver trukket ud i blå, røde og gule striber. Tuschen var en blanding, og vandet har skilt den ad. Samme idé bruges i laboratoriet til at undersøge, om et lægemiddel er rent.
Chromatografi
Chromatografi er en fælles betegnelse for metoder, der skiller en blanding ad ved at lade den vandre med en væske hen over et fast stof. Stofferne i blandingen vandrer med forskellig fart og bliver derfor skilt fra hinanden.
I tyndtlagschromatografi, som forkortes TLC, er det faste stof et tyndt lag på en plade.
- Den stationære fase er laget på pladen. Det er for det meste kiselgel, som er et fint, hvidt pulver af SiO2. Overfladen er dækket af OH-grupper og er derfor polær.
- Den mobile fase er den væske, der suges op gennem laget. Den kaldes også løbevæsken. Det er et organisk opløsningsmiddel eller en blanding af flere.
Sådan gør man
- Tegn en startlinje med blyant halvanden centimeter fra pladens nederste kant. Blæk fra en kuglepen ville selv løbe med op ad pladen.
- Opløs prøverne, og sæt en lille plet af hver på startlinjen med et tyndt glasrør. Pletten skal være lille, højst 2 mm. En stor plet bliver trukket ud og flyder sammen med nabopletterne.
- Stil pladen i et kar med lidt løbevæske i bunden, og læg låg på, så løbevæsken ikke fordamper. Væskens overflade skal være under startlinjen.
- Løbevæsken suges op gennem laget og tager stofferne med sig.
- Tag pladen op, når væsken næsten er nået til toppen. Tegn straks en streg ved væskefronten, før væsken fordamper.
De fleste lægemidler er farveløse, så pletterne kan ikke ses. Pladen lægges derfor under en lampe med ultraviolet lys. Laget på pladen indeholder et stof, der lyser grønt i ultraviolet lys. Stoffer med en benzenring eller andre konjugerede dobbeltbindinger absorberer det ultraviolette lys, og de viser sig derfor som mørke pletter.
Rf-værdien
Hvor langt en plet er løbet, angives med en Rf-værdi.
\[R_\mathrm{f} = \frac{\text{plettens afstand fra startlinjen}}{\text{væskefrontens afstand fra startlinjen}}\]
Afstanden måles til midten af pletten. Rf-værdien er et tal mellem 0 og 1 uden enhed.
Eksempel
En plet er løbet 3,6 cm, og væskefronten er løbet 5,0 cm.
\[R_\mathrm{f} = \frac{3{,}6\ \mathrm{cm}}{5{,}0\ \mathrm{cm}} = 0{,}72\]
Rf-værdien for et stof er den samme hver gang, så længe pladen og løbevæsken er de samme. Skifter man løbevæske, får stoffet en ny Rf-værdi.
Hvorfor løber stofferne forskelligt?
Hvert molekyle bliver trukket i to retninger. Pladen holder på det, og løbevæsken trækker det med.
- Et polært stof danner hydrogenbindinger til OH-grupperne på pladen. Det hænger fast og løber kort. Rf-værdien bliver lav.
- Et upolært stof bindes kun svagt til pladen. Det følger med løbevæsken og løber langt. Rf-værdien bliver høj.
Løbevæsken betyder lige så meget. En mere polær løbevæske er bedre til at trække polære stoffer løs fra pladen, så alle pletter løber længere.
Er løbevæsken for upolær, bliver alle pletter stående på startlinjen. Er den for polær, løber alle pletter med helt op til fronten. I begge tilfælde bliver stofferne ikke skilt ad. Man må prøve sig frem, til pletterne ligger spredt midt på pladen.
At læse en plade
En TLC-plade kan svare på tre spørgsmål.
- Er stoffet rent? Et rent stof giver én plet. Flere pletter i samme bane betyder en blanding.
- Hvad er stoffet? Sæt det ukendte stof og et kendt stof ved siden af hinanden. Løber de lige langt, kan det være det samme stof.
- Er reaktionen færdig? Sæt reaktanten og reaktionsblandingen ved siden af hinanden. Når pletten fra reaktanten er væk, er reaktionen løbet til ende.
Pladen viser, at tabletten indeholder mindst to stoffer, fordi bane 4 har to pletter. Den øverste plet er løbet lige så langt som acetylsalicylsyre, og den nederste lige så langt som koffein. Der er ingen plet ud for paracetamol. Tabletten indeholder altså acetylsalicylsyre og koffein, men ikke paracetamol.
To stoffer, der løber lige langt, er ikke nødvendigvis det samme stof. Vil man være sikker, gentager man forsøget med en anden løbevæske. Løber de to pletter stadig lige langt, er det meget sandsynligt, at stofferne er ens.
TLC er en kvalitativ metode. Den viser, hvilke stoffer der er i en prøve, men ikke præcist hvor meget. Det kræver en kvantitativ metode som spektrofotometri, som er emnet for afsnit B8.7.