B5.4 Standardkurven
Hvor meget farvestof er der i en rød sodavand? Det står ikke på flasken, men det kan måles. Man sammenligner sodavandens absorbans med absorbansen af opløsninger, hvor man kender koncentrationen. Metoden kaldes spektrofotometrisk analyse. Den bruges også til at kontrollere drikkevand, fødevarer og blodprøver.
Fremgangsmåden
- Stil spektrofotometeret på λmax for det farvede stof.
- Nulstil med en blindprøve.
- Mål absorbansen af en række standardopløsninger.
- Tegn standardkurven.
- Mål absorbansen af prøven.
- Find prøvens koncentration med standardkurven.
Trin 1 og 2 er forklaret i afsnit B5.2.
Resten af afsnittet følger ét eksempel: det røde farvestof E129 i en sodavand. Der måles ved 504 nm i kuvetter med lysvejen 1,00 cm. Koncentrationerne står i mikromolær, µM, som du mødte i afsnit B5.3. 1 µM er 10−6 M.
Standardopløsninger
En standardopløsning er en opløsning, hvor man kender koncentrationen af det farvede stof præcist. Man laver en hel række af dem med stigende koncentration.
Standardopløsningerne laves ved at fortynde en stamopløsning. Det er en opløsning med en højere koncentration, som man også kender præcist. Koncentrationen efter fortyndingen beregnes med fortyndingsformlen fra afsnit 5.1 i bogen til C-niveau:
\[ c_{\text{før}} \cdot V_{\text{før}} = c_{\text{efter}} \cdot V_{\text{efter}} \]
De andre standardopløsninger laves på samme måde med mere stamopløsning.
| Standard | Stamopløsning | Samlet volumen | Koncentration af E129 |
|---|---|---|---|
| 1 | 5,00 mL | 100,0 mL | 5,00 µM |
| 2 | 10,0 mL | 100,0 mL | 10,0 µM |
| 3 | 15,0 mL | 100,0 mL | 15,0 µM |
| 4 | 20,0 mL | 100,0 mL | 20,0 µM |
| 5 | 25,0 mL | 100,0 mL | 25,0 µM |
Målingerne
Først nulstilles spektrofotometeret med blindprøven, som her er rent vand. Derefter måles absorbansen af de fem standardopløsninger og af prøven. Alle målinger laves ved samme bølgelængde og i samme slags kuvette.
Sodavanden er for kraftigt farvet til at blive målt direkte. Derfor er prøven fortyndet: 10,0 mL sodavand er fyldt op til 100,0 mL med vand.
Standardkurven
Standardkurven er en graf med koncentrationen på den vandrette akse og absorbansen på den lodrette. Hver standardopløsning giver ét punkt.
Ifølge Lambert-Beers lov er \(A = \varepsilon \cdot l \cdot c\). Bølgelængden og kuvetten er de samme i alle målingerne, så \(\varepsilon \cdot l\) er et fast tal. Punkterne skal derfor ligge på en ret linje gennem (0, 0):
\[ A = a \cdot c \]
Tallet a er linjens hældning, og \(a = \varepsilon \cdot l\).
Ja, når punkterne ligger på en ret linje, der går gennem (0, 0). Så er absorbansen ligefrem proportional med koncentrationen. Det er dét, du skal skrive, når en opgave beder dig vise, at Lambert-Beers lov er opfyldt.
Hældningen findes ved at aflæse et punkt på linjen langt fra (0, 0). Ved 25,0 µM går linjen gennem absorbansen 0,650:
\[ a = \frac{A}{c} = \frac{0{,}650}{25{,}0\ \text{µM}} = 0{,}0260\ \text{µM}^{-1} \]
Enheden µM−1 læses “pr. mikromolær”. Standardkurven har altså ligningen A = 0,0260 µM−1 · c.
Med et regneark
I praksis taster man målingerne ind i et regneark og lader det tegne den bedste rette linje gennem punkterne. Det kaldes lineær regression. Regnearket skriver linjens ligning ved grafen. Her bliver den
\[ y = 0{,}0260x + 0{,}0002 \]
hvor y er absorbansen, og x er koncentrationen i µM. Tallet foran x er hældningen. Det sidste tal skulle være 0 ifølge Lambert-Beers lov, og det er det næsten.
Regnearket kan også vise tallet R2. Jo tættere R2 er på 1, jo bedre ligger punkterne på linjen.
Prøvens koncentration
Prøven har absorbansen 0,338. Koncentrationen kan findes på to måder.
Ved aflæsning: Gå vandret ud fra 0,338 på den lodrette akse, til du rammer linjen. Gå derefter lodret ned til den vandrette akse. Dér står koncentrationen, som er omkring 13 µM.
Ved beregning: Ligningen \(A = a \cdot c\) løses for c.
Tilbage til sodavanden
De 13,0 µM er koncentrationen i den fortyndede prøve. Sodavanden selv er mere koncentreret. Fortyndingsformlen bruges igen, denne gang for at finde koncentrationen før fortyndingen.
På en varedeklaration står indholdet i milligram pr. liter. I 1,00 L sodavand er der 1,30 · 10−4 mol E129, og molarmassen for E129 er 496,41 g/mol:
\[ m = n \cdot M = 1{,}30 \cdot 10^{-4}\ \mathrm{mol} \cdot 496{,}41\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{mol}} = 0{,}0645\ \mathrm{g} \]
Sodavanden indeholder altså 64,5 mg E129 pr. liter.
Standardkurven giver koncentrationen i den opløsning, der stod i kuvetten. Er prøven fortyndet, før den blev målt, skal du regne tilbage til den oprindelige opløsning.
Hældningen og ekstinktionskoefficienten
Standardkurvens hældning er \(a = \varepsilon \cdot l\). Ekstinktionskoefficienten findes derfor ved at dividere hældningen med lysvejen:
\[ \varepsilon = \frac{a}{l} = \frac{0{,}0260\ \text{µM}^{-1}}{1{,}00\ \mathrm{cm}} = 0{,}0260\ \text{µM}^{-1} \cdot \mathrm{cm^{-1}} \]
Når lysvejen er 1,00 cm, har ekstinktionskoefficienten samme tal som hældningen. Det er kun enheden, der er forskellig.
Enheden på ekstinktionskoefficienten følger enheden på den vandrette akse.
| Koncentrationen på den vandrette akse | Enheden på hældningen | Enheden på ε |
|---|---|---|
| M | M−1 | M−1 · cm−1 |
| mM | mM−1 | mM−1 · cm−1 |
| µM | µM−1 | µM−1 · cm−1 |
| mg/L | L/mg | L/(mg · cm) |
Der går en million µM på 1 M. Regnet pr. M bliver tallet derfor en million gange større: 0,0260 µM−1 · cm−1 er det samme som 2,60 · 104 M−1 · cm−1. Det er værdien fra tabellen i afsnit B5.3.
Det lineære område
Lambert-Beers lov gælder kun for fortyndede opløsninger. Laver man standardopløsninger med højere og højere koncentration, begynder punkterne at ligge under den rette linje.
Den del af grafen, hvor punkterne ligger på den rette linje, kaldes det lineære område. Kun dér kan standardkurven bruges.
Prøvens absorbans skal ligge mellem den laveste og den højeste standardopløsning. Er den for høj, fortynder man prøven og måler igen. Derfor blev sodavanden fortyndet, før den blev målt.
Stoffer uden farve
Mange stoffer er farveløse og kan ikke måles direkte med synligt lys. Så tilsætter man et reagens, der omdanner stoffet til et farvet stof.
Nitrit, NO2−, i drikkevand er et eksempel. Nitrit er farveløs. Tilsætter man to reagenser, sulfanilamid og et koblingsreagens, bliver hver nitrition til ét molekyle af et rødt farvestof. Jo mere nitrit vandet indeholder, jo mere rød bliver opløsningen.
Standardopløsningerne laves af nitrit og får tilsat de samme reagenser som prøven. Så kan standardkurven tegnes med koncentrationen af nitrit på den vandrette akse. Blindprøven indeholder vand og reagenser, men ingen nitrit.
Nu kan du gå hele vejen fra farven på en opløsning til et tal for, hvor meget stof den indeholder.
Prøv selv: Spektrofotometri: find farvestof og nitrit med en standardkurve.
Prøv selv: Lambert-Beers lov: læg linjen gennem punkterne, og aflæs en prøve.