A6.5 Chromatografi med tal
Hvor stærk er en chilisauce? Smagsdommere kan give et bud, men et laboratorium kan måle det: styrken afhænger af, hvor meget capsaicin saucen indeholder. Problemet er, at saucen er en blanding af hundredvis af stoffer. En titrering som i afsnit A6.4 kan ikke bruges, for mange af stofferne ville reagere med. Først skal capsaicin skilles fra resten, og så skal mængden måles. Chromatografi kan begge dele på én gang.
Fra plade til kolonne
I afsnit B8.6 lærte du om tyndtlagschromatografi, TLC. Alle former for chromatografi bygger på det samme: en mobil fase bevæger sig forbi en stationær fase, og stofferne i blandingen fordeler sig mellem de to. Et stof, der bindes stærkt til den stationære fase, kommer langsomt frem. Et stof, der helst vil være i den mobile fase, kommer hurtigt frem.
I TLC ser man kun, hvor langt pletterne er løbet. Skal man måle mængder, lægges den stationære fase i et rør, en kolonne, og en detektor måler stofferne, når de kommer ud i den anden ende.
Chromatogrammet
Detektorens signal tegnes som funktion af tiden. Grafen kaldes et chromatogram, og hvert stof giver en top.
Chromatogrammet giver to oplysninger om hvert stof:
- Retentionstiden, tR, er tiden fra prøven sprøjtes ind, til toppen kommer. Den fortæller, hvilket stof det er.
- Arealet under toppen fortæller, hvor meget der er af stoffet.
HPLC
Den mest brugte metode til stoffer i opløsning hedder HPLC. Den mobile fase er en væske, som pumpes gennem kolonnen ved højt tryk.
Detektoren er som regel et spektrofotometer, der måler absorbansen ved en bestemt bølgelængde, som i afsnit B5.3. Stoffer med benzenringe absorberer ultraviolet lys og er lette at måle.
Omvendt fase
I TLC er den stationære fase polær. I HPLC er det for det meste omvendt: kolonnen er fyldt med små korn, hvis overflade er dækket af lange carbonkæder. Den stationære fase er altså upolær, og den mobile fase er en polær blanding af vand og methanol eller ethanol. Det kaldes omvendt fase.
| TLC på kiselgel | HPLC med omvendt fase | |
|---|---|---|
| Stationær fase | polær | upolær |
| Mobil fase | mindre polær end pladen | polær |
| Polære stoffer | hænger fast og løber kort | følger den mobile fase og kommer først |
| Upolære stoffer | løber langt | holdes tilbage og kommer sidst |
Rækkefølgen kan forudsiges med en polaritetsanalyse eller med log P fra afsnit A3.6. Jo højere log P, jo længere retentionstid.
| Stof | log P | Retentionstid i chromatogrammet ovenfor |
|---|---|---|
| vanillin | 1,2 | 2,4 min |
| eugenol | 2,3 | 5,2 min |
| capsaicin | 3,0 | 8,1 min |
Vanillin er det mest polære af de tre og kommer først. Capsaicin med sin lange carbonkæde holdes længst tilbage.
Retentionstiden afhænger også af den mobile fase. Sættes der mere methanol i, bliver den mobile fase mindre polær. Så har de upolære stoffer lettere ved at følge med, og alle retentionstider bliver kortere.
Gaschromatografi
I gaschromatografi, GC, er den mobile fase en gas, fx helium eller dinitrogen. Den kaldes bæregassen. Den stationære fase er et tyndt lag væske på indersiden af et meget langt og tyndt rør.
Prøven skal fordampe, så GC kan kun bruges til stoffer, der tåler at blive varmet op uden at gå i stykker. På en upolær kolonne kommer stofferne ud efter kogepunkt: det stof, der har det laveste kogepunkt, kommer først.
| HPLC | GC | |
|---|---|---|
| Mobil fase | en væske | en gas |
| Bruges til | stoffer i opløsning, også store og følsomme molekyler | stoffer, der let fordamper |
| Rækkefølgen bestemmes mest af | polaritet | kogepunkt |
| Eksempler | lægemidler, vitaminer, farvestoffer og sødestoffer i mad | alkohol i blod, duftstoffer, fedtsyrer i olie |
Ethanol i blodet fra afsnit A5.3 måles med GC.
Hvilket stof er det?
En retentionstid siger ikke noget alene. Den skal sammenlignes med retentionstiden for en standard, som er en opløsning af det rene stof med kendt koncentration. Standarden og prøven skal køres på samme kolonne, med samme mobile fase og ved samme temperatur.
Her er betingelserne nogle andre end i det første chromatogram, så retentionstiderne er også nogle andre. Toppen ved 6,4 minutter i prøven har samme retentionstid som standarden. Prøven indeholder altså sandsynligvis capsaicin. De andre toppe er andre stoffer fra saucen.
To forskellige stoffer kan have samme retentionstid. Vil man være sikker, kan man tilsætte lidt standard til prøven og køre den igen. Bliver toppen højere uden at blive til to toppe, er det det samme stof.
Hvor meget er der?
Arealet under en top er proportionalt med koncentrationen af stoffet. Sammenhængen findes med en standardkurve, som du kender fra spektrofotometri i afsnit B5.4: man kører en række standarder med kendte koncentrationer og afbilder arealet som funktion af koncentrationen.
10,0 g chilisauce rystes med ethanol og filtreres, og udtrækket fyldes op til 100,0 mL. Udtrækket og fem standarder køres på HPLC.
| c(capsaicin) i mg/L | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 |
|---|---|---|---|---|---|
| Areal | 148 | 312 | 601 | 918 | 1210 |
Toppen for capsaicin i udtrækket har arealet 742. Bestem indholdet af capsaicin i saucen.
Standardkurven
Lineær regression giver modellen
\[ \text{areal} = 15{,}15\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}} \cdot c(\mathrm{capsaicin}) + 1{,}4 \]
Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9997. Skæringen 1,4 er meget lille i forhold til arealerne, så arealet er med god tilnærmelse proportionalt med koncentrationen.
Koncentrationen i udtrækket
\[ c(\mathrm{capsaicin}) = \frac{742 - 1{,}4}{15{,}15\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}}} = 48{,}9\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]
Massen af capsaicin
Udtrækket fylder 100,0 mL = 0,1000 L.
\[ m(\mathrm{capsaicin}) = c \cdot V = 48{,}9\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}1000\ \mathrm{L} = 4{,}89\ \mathrm{mg} \]
Indholdet i saucen
\[ \frac{m(\mathrm{capsaicin})}{m(\text{sauce})} = \frac{4{,}89\ \mathrm{mg}}{10{,}0\ \mathrm{g}} = 0{,}489\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{g}} \]
Konklusion
Saucen indeholder 0,489 mg capsaicin pr. gram, altså 489 mg pr. kg. Det er en stærk sauce.
Arealet 742 ligger mellem den mindste og den største standard. Sådan skal det være. Ligger prøven uden for standardkurven, skal den fortyndes og køres igen, for man ved ikke, om linjen fortsætter.
Med titrering og chromatografi kan du måle, hvor meget der er af et stof i mad, medicin og blod. Med enzymkinetikken fra afsnit A6.2 kan du regne på, hvor hurtigt kroppen omsætter det.
- Forklar rækkefølgen af toppene med stoffernes polaritet og med, hvilken fase der er polær. Nævn de funktionelle grupper.
- Sammenlign retentionstider med en standard, når du skal afgøre, om et stof er i prøven.
- Vis standardkurven med punkter og linje, og skriv modellen med symboler og enheder. Linjen må ikke tvinges gennem (0,0).
- Brug hele modellen med både hældning og skæring, når du beregner prøvens koncentration.
- Regn tilbage til den oprindelige prøve: husk volumenet af udtrækket og en eventuel fortynding.