A6.2 Enzymkinetik

Det skal du kunne

forklare, hvorfor hastigheden af en enzymreaktion nærmer sig en øvre grænse
opskrive Michaelis-Menten-ligningen og forklare v_max og K_M
undersøge, om målinger følger Michaelis-Menten-ligningen
bestemme v_max og K_M med et CAS-værktøj eller med en ret linje
forklare, hvornår en enzymreaktion er af første orden, og hvornår den er af nulte orden

Lactosefri mælk laves ved at tilsætte enzymet lactase, som spalter mælkens lactose til glucose og galactose. Mejeriet vil vide, hvor hurtigt det går, og hvor meget enzym der skal til. En enzymreaktion følger ikke de simple hastighedsudtryk fra kapitel A5. Den har sit eget.

Hastigheden når et loft

I et forsøg måles starthastigheden v ved forskellige koncentrationer af substrat. Mængden af enzym er den samme hver gang.

Figur 1: Starthastigheden for spaltningen af lactose med lactase ved syv koncentrationer af lactose.

Ved lave koncentrationer stiger hastigheden næsten proportionalt med koncentrationen. Ved høje koncentrationer flader kurven ud og nærmer sig en øvre grænse. Grænsen kaldes maksimalhastigheden, v_max.

Forklaringen er enzym-substrat-komplekset fra afsnit A6.1. Der er kun et bestemt antal enzymmolekyler, og hvert af dem kan kun arbejde på ét substratmolekyle ad gangen.

Figur 2: Jo mere substrat, jo flere enzymer er optaget.

Når alle enzymmolekyler er optaget, siger man, at enzymet er mættet. Så hjælper det ikke at tilsætte mere substrat. Kun mere enzym kan sætte farten op.

Michaelis-Menten-ligningen

Kurven beskrives af Michaelis-Menten-ligningen:

\[ v = \frac{v_\mathrm{max} \cdot [\mathrm{S}]}{K_\mathrm{M} + [\mathrm{S}]} \]

[S] er koncentrationen af substrat.
v_max er den hastighed, kurven nærmer sig, når alle enzymmolekyler er optaget.
K_M er Michaelis-konstanten. Den har samme enhed som [S].

Sættes [S] = K_M ind i ligningen, fås v = ½ · v_max. Michaelis-konstanten er altså den koncentration af substrat, der giver halvdelen af maksimalhastigheden.

	Fortæller	Afhænger af mængden af enzym?
v_max	hvor hurtigt det går, når enzymet er mættet	ja: dobbelt så meget enzym giver dobbelt så høj v_max
K_M	hvor meget substrat der skal til, før enzymet arbejder med halv fart	nej: den hører til enzymet og substratet

Et enzym med lille K_M bliver mættet ved en lav koncentration. Det binder sit substrat godt.

To grænsetilfælde

Figur 3: Michaelis-Menten-kurven har en ende af første orden og en ende af nulte orden.

Lidt substrat. Er [S] meget mindre end K_M, betyder [S] næsten intet i nævneren:

\[ v \approx \frac{v_\mathrm{max}}{K_\mathrm{M}} \cdot [\mathrm{S}] \]

Hastigheden er proportional med [S]. Reaktionen er af første orden med hensyn til substratet.

Meget substrat. Er [S] meget større end K_M, betyder K_M næsten intet i nævneren, og [S] kan forkortes væk:

\[ v \approx v_\mathrm{max} \]

Hastigheden afhænger ikke af [S]. Reaktionen er af nulte orden.

Det forklarer to eksempler fra kapitel A5: ibuprofen i afsnit A5.2 og ethanol i afsnit A5.3. De fleste lægemidler findes i kroppen i koncentrationer langt under K_M for de enzymer, der nedbryder dem. Derfor er nedbrydningen af første orden, som for ibuprofen. Ethanol findes efter et par genstande i en koncentration langt over K_M for enzymet alkoholdehydrogenase, som er omkring 1 mM. Enzymet er mættet, og forbrændingen er af nulte orden.

Bestem v_max og K_M

Med et CAS-værktøj

Michaelis-Menten-ligningen er ikke en ret linje, men et CAS-værktøj kan tilpasse den direkte til målingerne. Modellen skrives som y = a · x / (b + x), hvor a er v_max og b er K_M.

Eksempel: lactase

Starthastigheden for spaltningen af lactose er målt ved syv koncentrationer.

[lactose] i mM	5	10	20	40	80	120	160
v i µM/min	9,4	15,4	24,1	32,0	39,5	42,0	44,2

Undersøg, om målingerne følger Michaelis-Menten-ligningen, og bestem v_max og K_M.

Udtrykket, der skal undersøges

\[ v = \frac{v_\mathrm{max} \cdot [\mathrm{lactose}]}{K_\mathrm{M} + [\mathrm{lactose}]} \]

Graf og regression

Regression med modellen y = a · x / (b + x) giver a = 50,1 og b = 22,1. Grafen med punkter og model er figuren først i afsnittet.

Vurdering af modellen

Punkterne ligger tæt på kurven og tilfældigt over og under den. Målingerne følger Michaelis-Menten-ligningen.

Konklusion

v_max = 50,1 µM/min og K_M = 22,1 mM. Modellen er

\[ v = \frac{50{,}1\ \dfrac{\mathrm{\mu M}}{\mathrm{min}} \cdot [\mathrm{lactose}]}{22{,}1\ \mathrm{mM} + [\mathrm{lactose}]} \]

Mælk indeholder omkring 137 mM lactose. Det er 6 gange så meget som K_M, og modellen giver v = 43,1 µM/min, som er 86 % af v_max. Enzymet er altså næsten mættet, når det hældes i mælken.

Med en ret linje

Tager man den reciprokke værdi på begge sider af Michaelis-Menten-ligningen, fås et lineært udtryk:

\[ \frac{1}{v} = \frac{K_\mathrm{M}}{v_\mathrm{max}} \cdot \frac{1}{[\mathrm{S}]} + \frac{1}{v_\mathrm{max}} \]

I den rette linje y = a · x + b	I det lineære udtryk
y	1/v
x	1/[S]
hældningen a	K_M / v_max
skæringen b med y-aksen	1 / v_max

Grafen kaldes et Lineweaver-Burk-plot. Ligger punkterne på en ret linje, følger målingerne Michaelis-Menten-ligningen.

1/[lactose] i mM⁻¹	0,200	0,100	0,0500	0,0250	0,0125	0,00833	0,00625
1/v i min/µM	0,1064	0,0649	0,0415	0,0313	0,0253	0,0238	0,0226

Figur 4: 1/v som funktion af 1/[lactose] med den bedste rette linje.

Regressionen giver y = 0,434 · x + 0,0202 med r² = 0,9996, og punkterne ligger tilfældigt omkring linjen. Skæringen og hældningen giver

\[ v_\mathrm{max} = \frac{1}{b} = \frac{1}{0{,}0202\ \dfrac{\mathrm{min}}{\mathrm{\mu M}}} = 49{,}5\ \dfrac{\mathrm{\mu M}}{\mathrm{min}} \]

\[ K_\mathrm{M} = a \cdot v_\mathrm{max} = 0{,}434\ \dfrac{\mathrm{min \cdot mM}}{\mathrm{\mu M}} \cdot 49{,}5\ \dfrac{\mathrm{\mu M}}{\mathrm{min}} = 21{,}5\ \mathrm{mM} \]

De to metoder giver næsten det samme. Den lille forskel skyldes, at den rette linje lægger mest vægt på målingerne ved de laveste koncentrationer, som ligger længst til højre i grafen. Har du et CAS-værktøj, er den direkte tilpasning den bedste.

Inhibitorer ændrer kurven

De to slags inhibitorer fra afsnit A6.1 kan kendes fra hinanden på Michaelis-Menten-kurven.

Figur 5: Michaelis-Menten-kurven med og uden inhibitor.

Inhibitor	v_max	K_M	Forklaring
kompetitiv	uændret	større	Meget substrat fortrænger inhibitoren fra det aktive center, så loftet er det samme. Men der skal mere substrat til at nå halvdelen af det.
non-kompetitiv	mindre	uændret	En del af enzymmolekylerne er sat ud af spillet, uanset hvor meget substrat der er. Resten virker som før.

Til den skriftlige prøve

Skriv Michaelis-Menten-ligningen op med opgavens stof i stedet for S.
Vis grafen med målepunkter og model, og kommentér, hvordan punkterne ligger.
Angiv v_max og K_M med enheder. K_M har samme enhed som koncentrationen af substrat.
Skal du forklare reaktionens orden, så sammenlign [S] med K_M: meget mindre giver første orden, meget større giver nulte orden.
Bruger du den rette linje, så husk, at det er de reciprokke værdier, der afbildes, og at linjen ikke må tvinges gennem (0,0).

Kort sagt

Hastigheden af en enzymreaktion nærmer sig v_max, når enzymet er mættet med substrat.
Michaelis-Menten-ligningen er v = v_max · [S] / (K_M + [S]).
K_M er den koncentration af substrat, der giver halvdelen af v_max.
Ved lav [S] er reaktionen af første orden, og ved høj [S] er den af nulte orden.
v_max og K_M bestemmes med et CAS-værktøj eller af en ret linje for 1/v som funktion af 1/[S].
En kompetitiv inhibitor gør K_M større, og en non-kompetitiv inhibitor gør v_max mindre.

Se alle opgaver til emnet “Enzymkinetik” (A6.2)