Opgaver til A6.5

Opgaverne hører til afsnit A6.5 Chromatografi med tal. Prøv selv, før du åbner hjælpen under opgaven. Du skal bruge et regneark eller et CAS-værktøj til den lineære regression.

Opgave A6.5.1: Tre slags chromatografi

Tabellen skal sammenligne tre slags chromatografi: TLC på kiselgel, HPLC med omvendt fase og gaschromatografi, GC.

TLC på kiselgel HPLC med omvendt fase GC
Stationær fase
Mobil fase
Man bestemmer

De ni felter skal udfyldes med disse tekster:

  • en bæregas, fx helium
  • en løbevæske, som suges op gennem laget
  • en blanding af vand og methanol, som pumpes gennem kolonnen
  • et tyndt lag kiselgel på en plade
  • lange carbonkæder på overfladen af små korn i en kolonne
  • et tyndt lag væske på indersiden af et langt, tyndt rør
  • Rf-værdien
  • retentionstiden (skal bruges to gange)
  1. Tegn tabellen af, og udfyld den.
  2. Angiv, om den stationære fase er polær eller upolær i TLC på kiselgel og i HPLC med omvendt fase.
  3. Forklar, hvad de tre slags chromatografi har til fælles.
  4. Limonen fra appelsinskal er et upolært stof. Løber limonen langt eller kort på en TLC-plade med kiselgel? Kommer limonen tidligt eller sent ud af en HPLC-kolonne med omvendt fase?

Den stationære fase er den, der står stille. Den mobile fase er den, der bevæger sig. Find først de tre tekster på listen, som beskriver noget, der bevæger sig: en gas og to væsker. TLC er forklaret i afsnit B8.6, og HPLC og GC står i afsnit A6.5.

I TLC ligger den stationære fase på en plade. I HPLC ligger den i en kolonne med små korn. I GC sidder den på indersiden af et langt, tyndt rør. I TLC måler man, hvor langt en plet er løbet. I HPLC og GC måler man, hvor lang tid et stof er om at komme gennem kolonnen.

Du kan begynde svaret på spørgsmål c sådan: “I alle tre slags chromatografi bevæger en … fase sig forbi en … fase. Stofferne i blandingen …, og derfor …”

Til spørgsmål d: Et upolært stof som limonen bindes svagt til en polær stationær fase og stærkt til en upolær stationær fase.

  1. De tre slags chromatografi har disse faser:
TLC på kiselgel
Stationær fase et tyndt lag kiselgel på en plade
Mobil fase en løbevæske, som suges op gennem laget
Man bestemmer Rf-værdien
HPLC med omvendt fase
Stationær fase lange carbonkæder på overfladen af små korn i en kolonne
Mobil fase en blanding af vand og methanol, som pumpes gennem kolonnen
Man bestemmer retentionstiden
GC
Stationær fase et tyndt lag væske på indersiden af et langt, tyndt rør
Mobil fase en bæregas, fx helium
Man bestemmer retentionstiden

  1. I TLC på kiselgel er den stationære fase polær, fordi overfladen af kiselgel er dækket af OH-grupper. I HPLC med omvendt fase er den stationære fase upolær, fordi den består af lange carbonkæder. Det er altså omvendt af TLC, og derfor hedder det omvendt fase.

  2. I alle tre slags chromatografi bevæger en mobil fase sig forbi en stationær fase. Stofferne i blandingen fordeler sig forskelligt mellem de to faser. Et stof, der bindes stærkt til den stationære fase, kommer langsomt frem. Et stof, der helst vil være i den mobile fase, kommer hurtigt frem. Derfor bliver stofferne skilt ad.

  3. På en TLC-plade med kiselgel bindes det upolære limonen kun svagt til den polære plade, så limonen løber langt. I en HPLC-kolonne med omvendt fase bindes limonen stærkt til de upolære carbonkæder, så limonen holdes tilbage og kommer sent ud.

Opgave A6.5.2: Aflæs et chromatogram

En brun vingummi er farvet med en blanding af tre farvestoffer, som her kaldes A, B og C. Vingummien opløses i varmt vand, og opløsningen køres på HPLC. Figuren viser chromatogrammet. Arealet under hver top står over toppen.

Figur 1: Chromatogrammet af opløsningen af den brune vingummi har tre toppe.
  1. Aflæs retentionstiden for hver af de tre toppe.
  2. Hvilket af de tre farvestoffer bindes stærkest til den stationære fase? Begrund svaret.
  3. Hvad fortæller arealet under en top?
  4. Opløsningen af vingummien fortyndes med vand til det dobbelte volumen og køres igen under de samme betingelser. Angiv retentionstiden og arealet for top B i det nye chromatogram.

Retentionstiden er tiden fra prøven sprøjtes ind, til toppen kommer. Gå fra spidsen af hver top i chromatogrammet af vingummien lodret ned til tidsaksen, og aflæs tiden. De små streger på aksen viser halve minutter.

Top A i chromatogrammet af vingummien ligger midt mellem 2 og 3 minutter. Et farvestof, der bindes stærkt til den stationære fase, kommer langsomt frem gennem kolonnen.

Retentionstiden fortæller, hvilket stof det er, og arealet fortæller, hvor meget der er. Tænk over, hvilken af de to der ændrer sig, når koncentrationen af farvestof B bliver halvt så stor.

  1. I chromatogrammet af vingummien aflæses tR = 2,5 min for top A, tR = 4,0 min for top B og tR = 7,5 min for top C.

  2. Farvestof C bindes stærkest til den stationære fase. Top C har den længste retentionstid, og et stof, der bindes stærkt til den stationære fase, kommer langsomt frem gennem kolonnen.

  3. Arealet under en top fortæller, hvor meget der er af stoffet. Arealet er proportionalt med stoffets koncentration i den opløsning, der sprøjtes ind. Arealerne for to forskellige farvestoffer kan ikke sammenlignes direkte, for detektoren reagerer ikke lige kraftigt på alle stoffer. Derfor skal hvert stof have sin egen standard.

  4. Retentionstiden for top B er stadig 4,0 min, for retentionstiden afhænger af stoffet og ikke af mængden. Koncentrationen af farvestof B er blevet halvt så stor, så arealet bliver også halvt så stort:

\[ \text{areal} = \frac{520}{2} = 260 \]

Opgave A6.5.3: Aromastoffer efter log P

Fire aromastoffer skal skilles ad med HPLC med omvendt fase. Tabellen viser stoffernes log P.

Aromastof Findes i log P
thymol timian 3,3
benzaldehyd bitre mandler 1,5
limonen appelsinskal 4,6
kanelaldehyd kanel 1,9
  1. Angiv, hvilket af de fire aromastoffer der er mest polært, og hvilket der er mest upolært.
  2. I hvilken rækkefølge kommer de fire aromastoffer ud af kolonnen?
  3. Forklar rækkefølgen ud fra den stationære og den mobile fase.
  4. Den mobile fase er en blanding af lige dele vand og methanol, og limonen kommer først ud efter 30 minutter. Laboratoriet skifter til en mobil fase med 20 % vand og 80 % methanol. Forklar, hvad der sker med retentionstiderne.

Størrelsen log P fortæller, om et stof helst vil være i vand eller i octan-1-ol, se afsnit A3.6. Jo højere log P, jo mere upolært er stoffet. I HPLC med omvendt fase er den stationære fase upolær, og den mobile fase er polær. Tænk over, hvilken af de to faser et upolært aromastof som limonen helst vil være i.

Sæt de fire aromastoffer i rækkefølge efter log P med det laveste tal først. Aromastoffet med den laveste log P kommer først ud af kolonnen.

Du kan begynde forklaringen sådan: “Den stationære fase er …, og den mobile fase er … Et upolært aromastof som limonen bindes til carbonkæderne med … og bliver derfor … Et mere polært aromastof som benzaldehyd …”

Til spørgsmål d: Methanol er mindre polært end vand. Tænk over, om de upolære aromastoffer får lettere eller sværere ved at følge med en mobil fase, der er mindre polær.

  1. Benzaldehyd har den laveste log P, 1,5, og er det mest polære af de fire aromastoffer. Limonen har den højeste log P, 4,6, og er det mest upolære.

  2. Rækkefølgen er benzaldehyd, kanelaldehyd, thymol og til sidst limonen. Jo højere log P, jo længere retentionstid.

  3. I HPLC med omvendt fase er den stationære fase upolær, fordi kornene i kolonnen er dækket af lange carbonkæder. Den mobile fase er en polær blanding af vand og methanol. Et upolært aromastof som limonen bindes til carbonkæderne med londonbindinger og bliver holdt længe tilbage. Et mere polært aromastof som benzaldehyd følger lettere med den polære mobile fase og kommer derfor først ud.

  4. Methanol er mindre polært end vand, så den mobile fase bliver mindre polær, når der kommer mere methanol i. Så har de upolære aromastoffer lettere ved at følge med den mobile fase, og alle fire retentionstider bliver kortere. Limonen kommer ud længe før de 30 minutter, og analysen går hurtigere. Rækkefølgen af de fire aromastoffer er den samme.

Opgave A6.5.4: Polaritetsanalyse af to lægemidler

Nogle tabletter mod smerter indeholder både paracetamol og ibuprofen. Figuren viser de to stoffer. En opløsning af en tablet køres på HPLC med omvendt fase. Den mobile fase er en blanding af vand og methanol med pH 3. Ibuprofen er en svag syre med pKs = 4,4, så ved pH 3 er ibuprofen mest på sin uladede syreform.

Figur 2: Strukturformlerne for paracetamol og ibuprofen.
  1. Angiv de polære grupper i paracetamol og i ibuprofen.
  2. Lav en polaritetsanalyse af paracetamol og af ibuprofen, og afgør, hvilket af de to stoffer der er mest polært.
  3. Hvilket af de to stoffer kommer først ud af kolonnen? Begrund svaret.
  4. pH i den mobile fase hæves til 7. Forklar, hvad der sker med retentionstiden for ibuprofen.

En polaritetsanalyse vejer de polære grupper mod de upolære dele af molekylet, se afsnit A3.6. Find grupperne med O−H, N−H og C=O i paracetamol og i ibuprofen, og tæl carbonatomerne i hvert molekyle. Hvert hjørne og hver ende af en streg er et carbonatom. Tommelfingerreglen er, at én polær gruppe kan trække omkring fire carbonatomer med ned i vand.

Paracetamol har en hydroxygruppe og en amidgruppe og 8 carbonatomer. Ibuprofen har en carboxylgruppe og 13 carbonatomer.

Du kan begynde begrundelsen i spørgsmål c sådan: “I omvendt fase er den stationære fase …, og den mobile fase er … Det mest polære af de to lægemidler … og kommer derfor …”

Til spørgsmål d: Ved pH 7 ligger pH langt over pKs for ibuprofen. Hvilken form er ibuprofen så på, og er den form mere eller mindre polær end syreformen?

  1. Paracetamol har to polære grupper: en hydroxygruppe, som sidder på benzenringen, og en amidgruppe, −NH−CO−. Ibuprofen har én polær gruppe: en carboxylgruppe, −COOH.

  2. Paracetamol: Hydroxygruppen og amidgruppen kan begge danne hydrogenbindinger til vand. De upolære dele er benzenringen og en methylgruppe, i alt 8 carbonatomer. Der er altså 4 carbonatomer pr. polær gruppe, og det er lige på grænsen efter tommelfingerreglen. Paracetamol er et ret polært molekyle.

Ibuprofen: Carboxylgruppen er den eneste polære gruppe. Den skal bære 13 carbonatomer i benzenringen og de to sidekæder, og det er alt for mange. Ibuprofen er overvejende upolært.

Paracetamol er altså det mest polære af de to stoffer. Det passer med, at log P er 0,5 for paracetamol og 4,0 for ibuprofen.

  1. Paracetamol kommer først ud af kolonnen. I omvendt fase er den stationære fase upolær, og den mobile fase er polær. Det polære paracetamol følger med den mobile fase. Det upolære ibuprofen bindes med londonbindinger til carbonkæderne i den stationære fase og holdes tilbage.

  2. Ved pH 7 ligger pH langt over pKs = 4,4, så næsten al ibuprofen er på baseformen, hvor carboxylgruppen er blevet til −COO−. Ionen er meget mere polær end syreformen og følger lettere med den polære mobile fase. Retentionstiden for ibuprofen bliver derfor kortere. Paracetamol har ingen gruppe, der skifter form mellem pH 3 og pH 7, så retentionstiden for paracetamol ændres ikke.

Opgave A6.5.5: Duftstoffer på GC

Olien fra appelsinskal er en blanding af duftstoffer. Tabellen viser fire af dem. Olien undersøges med gaschromatografi, GC, på en upolær kolonne.

Duftstof Kogepunkt
limonen 176 °C
α-pinen 156 °C
linalool 198 °C
myrcen 167 °C

Et laboratorium skal også lave de fire analyser i den næste tabel og kan vælge mellem HPLC og GC.

Nr. Analyse Oplysning
1 ethanol i en blodprøve ethanol koger ved 78 °C
2 C-vitamin i en juice C-vitamin går i stykker ved opvarmning
3 duftstoffer i en parfume duftstoffer fordamper let
4 insulin i et lægemiddel insulin er et protein
  1. I hvilken rækkefølge kommer de fire duftstoffer fra appelsinskal ud af GC-kolonnen? Begrund svaret.
  2. Angiv den mobile fase i GC, og forklar, hvorfor prøven skal varmes op.
  3. Vælg for hver af de fire analyser, om HPLC eller GC passer bedst. Begrund hvert valg.

På en upolær GC-kolonne kommer stofferne ud efter kogepunkt. Sæt de fire duftstoffer fra appelsinskal i rækkefølge efter kogepunkt. Til spørgsmål c: I GC er den mobile fase en gas, så stofferne skal kunne fordampe uden at gå i stykker. I HPLC er stofferne opløst i en væske.

Duftstoffet med det laveste kogepunkt, α-pinen, kommer først ud af GC-kolonnen.

Du kan begynde begrundelserne i spørgsmål c sådan: “Ethanol i en blodprøve måles bedst med …, fordi ethanol …” og “C-vitamin i en juice måles bedst med …, fordi C-vitamin …” Et protein som insulin er et meget stort molekyle. Tænk over, om det kan fordampe.

  1. Rækkefølgen er α-pinen (156 °C), myrcen (167 °C), limonen (176 °C) og til sidst linalool (198 °C). På en upolær GC-kolonne kommer stoffet med det laveste kogepunkt først ud.

  2. Den mobile fase i GC er en bæregas, fx helium eller dinitrogen. Prøven skal varmes op, så stofferne fordamper. Kun som gas kan duftstofferne følge med bæregassen gennem kolonnen.

  3. De fire analyser:

Nr. Metode Begrundelse
1 GC ethanol fordamper let og tåler opvarmning
2 HPLC C-vitamin tåler ikke at blive varmet op til en gas
3 GC duftstoffer fordamper let
4 HPLC insulin er et meget stort molekyle, som ikke kan fordampe

I HPLC er stofferne opløst i en væske og skal ikke fordampe. Derfor bruges HPLC til store og følsomme molekyler som C-vitamin og insulin.

Opgave A6.5.6: Sødestoffer i tyggegummi

Et laboratorium vil finde ud af, hvilke sødestoffer et sukkerfrit tyggegummi indeholder. Tyggegummiet rystes med vand, og udtrækket køres på HPLC. Under de samme betingelser køres standarder af tre sødestoffer.

Standard Retentionstid
acesulfam K 2,1 min
saccharin 3,0 min
aspartam 5,6 min

Chromatogrammet af udtrækket fra tyggegummiet har tre toppe. Retentionstiderne er 2,1 min, 5,6 min og 7,9 min.

  1. Afgør, hvilke af de tre sødestoffer tyggegummiet indeholder.
  2. Begrund, at tyggegummiet ikke indeholder saccharin.
  3. Hvad kan laboratoriet sige om toppen ved 7,9 min?
  4. To forskellige stoffer kan have samme retentionstid. Forklar, hvordan laboratoriet kan blive mere sikkert på, at toppen ved 5,6 min er aspartam.

En retentionstid siger ikke noget alene. Sammenlign retentionstiden for hver af de tre toppe i udtrækket fra tyggegummiet med retentionstiderne for de tre standarder. Har en top samme retentionstid som en standard, er det sandsynligvis det samme stof.

Toppen ved 2,1 min i udtrækket fra tyggegummiet har samme retentionstid som standarden med acesulfam K. Led efter en top ved 3,0 min, hvor saccharin ville komme.

Du kan begynde svaret på spørgsmål d sådan: “Laboratoriet kan tilsætte lidt … til udtrækket og køre det igen. Hvis toppen ved 5,6 min bliver … uden at …, er det …”

  1. Tyggegummiet indeholder sandsynligvis acesulfam K og aspartam. Toppen ved 2,1 min har samme retentionstid som standarden med acesulfam K, og toppen ved 5,6 min har samme retentionstid som standarden med aspartam. Sammenligningen gælder kun, fordi standarderne og udtrækket er kørt på samme kolonne, med samme mobile fase og ved samme temperatur.

  2. Standarden med saccharin har retentionstiden 3,0 min. Chromatogrammet af udtrækket fra tyggegummiet har ingen top ved 3,0 min, så tyggegummiet indeholder ikke saccharin.

  3. Toppen ved 7,9 min har ikke samme retentionstid som nogen af de tre standarder. Den er altså hverken acesulfam K, saccharin eller aspartam. Det er et andet stof fra tyggegummiet, fx et aromastof. Laboratoriet kan først sige, hvilket stof det er, når en standard med samme retentionstid er fundet.

  4. Laboratoriet kan tilsætte lidt aspartam til udtrækket fra tyggegummiet og køre det igen. Hvis toppen ved 5,6 min bliver højere uden at blive til to toppe, er det det samme stof. Bliver der to toppe tæt ved hinanden, er stoffet i tyggegummiet ikke aspartam.

Opgave A6.5.7: C-vitamin i juice med én standard

Et laboratorium vil hurtigt tjekke indholdet af C-vitamin i en appelsinjuice med HPLC. C-vitamin er stoffet ascorbinsyre. En standard med 50,0 mg/L ascorbinsyre giver en top med arealet 425. Juicen fortyndes 10 gange med vand og køres under de samme betingelser. Toppen for ascorbinsyre i den fortyndede juice har arealet 357.

  1. Beregn koncentrationen af ascorbinsyre i den fortyndede juice. Antag, at arealet er proportionalt med koncentrationen.
  2. Beregn koncentrationen af ascorbinsyre i juicen, og beregn massen af ascorbinsyre i 100 mL juice.
  3. På kartonen står der, at juicen indeholder 40 mg C-vitamin pr. 100 mL. Vurdér, om det passer med målingen.
  4. Forklar, hvorfor en standardkurve med fem standarder giver et mere sikkert resultat end én standard.

Når arealet er proportionalt med koncentrationen, er forholdet mellem to koncentrationer af ascorbinsyre det samme som forholdet mellem de to arealer. Den fortyndede juice har et mindre areal end standarden, så koncentrationen i den fortyndede juice er mindre end 50,0 mg/L.

Koncentrationen af ascorbinsyre i den fortyndede juice er 50,0 mg/L ganget med forholdet mellem de to arealer, 357 / 425. Juicen er fortyndet 10 gange, så koncentrationen i selve juicen er 10 gange så stor. Massen i 100 mL findes med m = c · V, hvor V = 0,100 L.

Du kan begynde forklaringen i spørgsmål d sådan: “Med én standard må man antage, at … Med fem standarder kan man se på grafen, om …”

  1. Arealet er proportionalt med koncentrationen af ascorbinsyre. Forholdet mellem de to koncentrationer er derfor det samme som forholdet mellem de to arealer:

\[ c(\text{fortyndet juice}) = c(\text{standard}) \cdot \frac{\text{areal(fortyndet juice)}}{\text{areal(standard)}} \]

\[ c(\text{fortyndet juice}) = 50{,}0\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot \frac{357}{425} = 42{,}0\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

  1. Juicen er fortyndet 10 gange, så koncentrationen af ascorbinsyre i juicen er

\[ c(\text{juice}) = 10 \cdot 42{,}0\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} = 420\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

100 mL er 0,100 L:

\[ m(\text{ascorbinsyre}) = c \cdot V = 420\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}100\ \mathrm{L} = 42{,}0\ \mathrm{mg} \]

Juicen indeholder 42,0 mg ascorbinsyre pr. 100 mL.

  1. Målingen giver 42 mg C-vitamin pr. 100 mL, og på kartonen står der 40 mg pr. 100 mL. Forskellen er 2 mg, altså 5 % af de 40 mg. Oplysningen på kartonen passer godt med målingen, når man husker, at målingen kun bygger på én standard.

  2. Med én standard må man antage, at arealet er proportionalt med koncentrationen af ascorbinsyre, altså at linjen går gennem (0,0). Det kan ikke kontrolleres med ét punkt. Er der en fejl i den ene standard, bliver resultatet lige så forkert. Med fem standarder kan man se på grafen, om punkterne ligger på en ret linje, og regressionen finder både hældning og skæring. En fejl i en enkelt standard betyder mindre, og den kan ses som et punkt, der ligger ved siden af linjen.

Opgave A6.5.8: Paracetamol i en tablet

På pakken står der, at en tablet indeholder 500 mg paracetamol. Et laboratorium kontrollerer indholdet med HPLC.

En tablet knuses og opløses i en blanding af vand og methanol, og opløsningen fyldes op til 500,0 mL. Den kaldes opløsning A. Derefter fortyndes opløsning A 20 gange: 5,00 mL fyldes op til 100,0 mL. Den kaldes opløsning B. Opløsning B og fem standarder køres på HPLC.

c(paracetamol) i mg/L 10 20 40 60 80
Areal 217 436 847 1296 1703

Toppen for paracetamol i opløsning B har arealet 1051.

  1. Tegn standardkurven for paracetamol, og bestem modellen ved lineær regression.
  2. Bestem koncentrationen af paracetamol i opløsning B.
  3. Beregn massen af paracetamol i tabletten, og sammenlign med de 500 mg på pakken.
  4. Laboratoriet kørte først opløsning A uden at fortynde den. Toppen for paracetamol fik arealet 17 880. Forklar, hvorfor det areal ikke kan bruges sammen med standardkurven.

Afbild arealet som funktion af koncentrationen af paracetamol for de fem standarder, og lav lineær regression i et regneark eller et CAS-værktøj. Linjen må ikke tvinges gennem (0,0). Sæt derefter arealet for opløsning B ind i modellen, og løs for koncentrationen. Brug både hældning og skæring.

Regressionen for paracetamol giver hældningen 21,28 L/mg og skæringen 5,9. Koncentrationen i opløsning B er (areal − skæring) / hældning. Opløsning A er 20 gange så koncentreret som opløsning B. Hele tabletten er opløst i de 500,0 mL = 0,5000 L af opløsning A, så massen af paracetamol er m = c · V.

Til spørgsmål d: Sammenlign arealet 17 880 med arealet af den største standard med paracetamol. Du kan begynde sådan: “Arealet ligger langt over …, og man ved ikke, om …”

  1. Arealet afbildes som funktion af koncentrationen af paracetamol.
Figur 3: Standardkurven for paracetamol med den bedste rette linje.

Lineær regression giver modellen

\[ \text{areal} = 21{,}28\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}} \cdot c(\mathrm{paracetamol}) + 5{,}9 \]

Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9998. Modellen beskriver målingerne godt.

  1. Arealet for opløsning B sættes ind i modellen:

\[ c(\mathrm{paracetamol}) = \frac{1051 - 5{,}9}{21{,}28\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}}} = 49{,}1\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

Arealet 1051 ligger mellem den mindste og den største standard, så modellen kan bruges.

  1. Opløsning A er 20 gange så koncentreret som opløsning B:

\[ c(\text{opløsning A}) = 20 \cdot 49{,}1\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} = 982\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

Hele tabletten er opløst i 500,0 mL = 0,5000 L:

\[ m(\mathrm{paracetamol}) = c \cdot V = 982\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}5000\ \mathrm{L} = 491\ \mathrm{mg} \]

Tabletten indeholder 491 mg paracetamol. Det er 98,2 % af de 500 mg på pakken:

\[ \text{andel} = \frac{491\ \mathrm{mg}}{500\ \mathrm{mg}} \cdot 100\ \% = 98{,}2\ \% \]

Indholdet passer altså godt med oplysningen på pakken.

  1. Den største standard med paracetamol har arealet 1703. Arealet 17 880 for opløsning A er omkring ti gange så stort og ligger langt uden for standardkurven. Man ved ikke, om linjen fortsætter så højt op. Detektoren kan ikke nødvendigvis følge med ved så høje koncentrationer. Sætter man alligevel 17 880 ind i modellen, får man 840 mg/L og dermed kun 420 mg paracetamol i tabletten. Derfor skal opløsning A fortyndes, så arealet kommer til at ligge mellem den mindste og den største standard.

Opgaver i eksamensstil

Opgaverne ligner dem, du møder til den skriftlige prøve i kemi A. Skriv svarene, som du ville gøre til prøven: med model, graf, beregning med enheder og en konklusion.

Opgave A6.5.eks.1: Parabener i en håndcreme

Parabener er konserveringsmidler, som forhindrer bakterier og svampe i at vokse i cremer. Nogle parabener er mistænkt for at forstyrre kroppens hormoner, og derfor har EU sat grænser for indholdet. En creme må højst indeholde 0,4 masseprocent methylparaben.

Et laboratorium undersøger en håndcreme med HPLC med omvendt fase. 1,00 g håndcreme rystes med methanol og filtreres, og udtrækket fyldes op til 100,0 mL. Figuren viser fire parabener og chromatogrammet af udtrækket. Arealet under hver top står over toppen.

Figur 4: De fire parabener og chromatogrammet af udtrækket fra håndcremen.

Standarder af de fire parabener er kørt under de samme betingelser som udtrækket.

Standard log P Retentionstid
methylparaben 2,0 2,6 min
ethylparaben 2,5 3,7 min
propylparaben 3,0 5,6 min
butylparaben 3,6 8,8 min

Til standardkurven er der kørt fem standarder med methylparaben.

c(methylparaben) i mg/L 5 10 20 30 40
Areal 158 319 654 950 1299
  1. Afgør, hvilke af de fire parabener håndcremen indeholder.
  2. Forklar ud fra parabenernes opbygning, at retentionstiden stiger fra methylparaben til butylparaben.
  3. Bestem masseprocenten af methylparaben i håndcremen.
  4. Vurdér, om håndcremen overholder grænsen for methylparaben. Inddrag, hvad det betyder for resultatet, hvis methanolen ikke har trukket al methylparaben ud af cremen.

Sammenlign retentionstiderne for de tre toppe i chromatogrammet af håndcremen med retentionstiderne for de fire standarder. Til spørgsmål b: Find det, de fire parabener har til fælles, og det, der er forskelligt, og husk, at den stationære fase er upolær i omvendt fase. Til spørgsmål c: Lav lineær regression på de fem standarder med methylparaben, og brug arealet af den top, som er methylparaben.

Top B i chromatogrammet af håndcremen har retentionstiden 2,6 min ligesom standarden med methylparaben, og arealet er 812. Regressionen for methylparaben giver hældningen 32,37 L/mg og skæringen −3,7. Find koncentrationen i udtrækket, derefter massen af methylparaben i de 100,0 mL = 0,1000 L, og divider til sidst med massen af håndcremen, 1,00 g = 1000 mg.

Du kan begynde forklaringen i spørgsmål b sådan: “De fire parabener har de samme polære grupper: … Forskellen er … Jo længere carbonkæde, jo … Den stationære fase er …, så …”

  1. Retentionstiderne i chromatogrammet af håndcremen sammenlignes med standardernes retentionstider.
Top Retentionstid Samme retentionstid som
A 1,4 min ingen af de fire standarder
B 2,6 min methylparaben
C 5,6 min propylparaben

Håndcremen indeholder altså sandsynligvis methylparaben og propylparaben. Der er ingen toppe ved 3,7 min og 8,8 min, så håndcremen indeholder ikke ethylparaben og butylparaben. Top A er et andet stof fra cremen.

  1. De fire parabener har de samme polære grupper: en hydroxygruppe på benzenringen og en estergruppe. Den eneste forskel er carbonkæden i estergruppen, som vokser fra ét carbonatom i methylparaben til fire carbonatomer i butylparaben. Jo længere carbonkæden er, jo større er den upolære del af molekylet, og jo mere upolært er stoffet. Det ses også på log P, som stiger fra 2,0 til 3,6.

I HPLC med omvendt fase er den stationære fase upolær, fordi den består af lange carbonkæder, og den mobile fase er polær. En paraben med en lang carbonkæde bindes stærkere til den stationære fase med londonbindinger og holdes længere tilbage. Derfor stiger retentionstiden fra methylparaben til butylparaben.

  1. Arealet af en top er proportionalt med koncentrationen, så sammenhængen mellem areal og koncentration er lineær:

\[ \text{areal} = a \cdot c(\mathrm{methylparaben}) + b \]

Arealet afbildes som funktion af koncentrationen for de fem standarder.

Figur 5: Standardkurven for methylparaben med den bedste rette linje.

Lineær regression giver modellen

\[ \text{areal} = 32{,}37\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}} \cdot c(\mathrm{methylparaben}) - 3{,}7 \]

Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9995. Modellen beskriver målingerne godt.

Top B er methylparaben og har arealet 812. Arealet ligger mellem den mindste og den største standard. Koncentrationen i udtrækket er

\[ c(\mathrm{methylparaben}) = \frac{812 - (-3{,}7)}{32{,}37\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}}} = 25{,}2\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

Udtrækket fylder 100,0 mL = 0,1000 L:

\[ m(\mathrm{methylparaben}) = c \cdot V = 25{,}2\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}1000\ \mathrm{L} = 2{,}52\ \mathrm{mg} \]

Håndcremen vejede 1,00 g = 1000 mg:

\[ \frac{m(\mathrm{methylparaben})}{m(\text{håndcreme})} \cdot 100\ \% = \frac{2{,}52\ \mathrm{mg}}{1000\ \mathrm{mg}} \cdot 100\ \% = 0{,}252\ \% \]

Håndcremen indeholder 0,252 masseprocent methylparaben.

  1. Indholdet på 0,252 % ligger under grænsen på 0,4 %, så håndcremen overholder grænsen for methylparaben.

Har methanolen ikke trukket al methylparaben ud af cremen, er det målte indhold for lavt, og det rigtige indhold er højere end 0,252 %. Forholdet mellem det målte indhold og grænsen er

\[ \text{forhold} = \frac{0{,}252\ \%}{0{,}4\ \%} = 0{,}63 \]

Håndcremen overskrider altså først grænsen, hvis mindre end 63 % af methylparabenen er kommet med over i udtrækket. Så dårlig en udtrækning er ikke sandsynlig, så konklusionen holder. Indholdet af propylparaben kan ikke bestemmes ud fra målingerne, for det kræver en standardkurve for propylparaben.

Opgave A6.5.eks.2: Methanol i ulovlig spiritus

Spiritus, der er fremstillet ulovligt, kan indeholde methanol. Methanol er giftigt: omkring 8 g methanol kan give varige skader på synet, og større mængder kan være dødelige. Politiet har beslaglagt en flaske spiritus, og et laboratorium undersøger den med gaschromatografi, GC, på en upolær kolonne.

Først køres en standard med fire alkoholer. Derefter fortyndes 5,00 mL af spiritussen med vand til 250,0 mL, altså 50 gange, og den fortyndede spiritus køres under de samme betingelser. Figuren viser de to chromatogrammer.

Figur 6: Chromatogrammerne af standarden med fire alkoholer og af den fortyndede spiritus.

Tabellen viser de fire alkoholer i standarden.

Alkohol Formel Kogepunkt
methanol CH3OH 65 °C
ethanol CH3CH2OH 78 °C
propan-1-ol CH3CH2CH2OH 97 °C
butan-1-ol CH3CH2CH2CH2OH 118 °C

Til standardkurven er der kørt fem standarder med methanol.

c(methanol) i g/L 0,50 1,00 2,00 3,00 4,00
Areal 206 420 834 1232 1657
  1. Afgør, hvilke af de fire alkoholer spiritussen indeholder.
  2. Forklar ud fra alkoholernes opbygning rækkefølgen af de fire toppe i chromatogrammet af standarden.
  3. Bestem koncentrationen af methanol i spiritussen i g/L.
  4. Vurdér, hvor meget af spiritussen en person kan drikke, før der er fare for varige skader på synet.

Sammenlign retentionstiderne for toppene i chromatogrammet af den fortyndede spiritus med retentionstiderne i chromatogrammet af standarden. Til spørgsmål b: På en upolær GC-kolonne kommer stofferne ud efter kogepunkt, så du skal forklare, hvorfor kogepunktet stiger fra methanol til butan-1-ol. Til spørgsmål c: Lav lineær regression på de fem standarder med methanol, og husk, at spiritussen er fortyndet 50 gange.

Top A i chromatogrammet af den fortyndede spiritus har retentionstiden 1,8 min ligesom methanol i standarden, og arealet er 977. Regressionen for methanol giver hældningen 412,5 L/g og skæringen 3,7. Koncentrationen i den fortyndede spiritus ganges med 50. Til spørgsmål d: Find det volumen spiritus, der indeholder 8 g methanol, med V = m / c.

Du kan begynde forklaringen i spørgsmål b sådan: “De fire alkoholer har alle en …, men carbonkæden … Jo længere carbonkæde, jo stærkere … mellem molekylerne, og jo højere … På en upolær GC-kolonne kommer …”

  1. Chromatogrammet af den fortyndede spiritus har to toppe. Top A har retentionstiden 1,8 min ligesom methanol i standarden. Top B har retentionstiden 2,7 min ligesom ethanol i standarden. Spiritussen indeholder altså methanol og ethanol. Der er ingen toppe ved 4,3 min og 6,9 min, hvor propan-1-ol og butan-1-ol kommer i standarden, så spiritussen indeholder ikke propan-1-ol og butan-1-ol.

  2. De fire alkoholer har alle én hydroxygruppe, som kan danne hydrogenbindinger. Forskellen er carbonkæden, som vokser fra ét carbonatom i methanol til fire carbonatomer i butan-1-ol. Jo længere carbonkæden er, jo flere elektroner har molekylet, og jo stærkere er londonbindingerne mellem molekylerne. Derfor stiger kogepunktet fra 65 °C for methanol til 118 °C for butan-1-ol.

På en upolær GC-kolonne kommer stoffet med det laveste kogepunkt først ud. En alkohol med en lang carbonkæde bindes også stærkere til den upolære stationære fase med londonbindinger. Rækkefølgen bliver derfor methanol, ethanol, propan-1-ol og butan-1-ol.

  1. Arealet af en top er proportionalt med koncentrationen, så sammenhængen mellem areal og koncentration er lineær:

\[ \text{areal} = a \cdot c(\mathrm{methanol}) + b \]

Arealet afbildes som funktion af koncentrationen for de fem standarder.

Figur 7: Standardkurven for methanol med den bedste rette linje.

Lineær regression giver modellen

\[ \text{areal} = 412{,}5\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{g}} \cdot c(\mathrm{methanol}) + 3{,}7 \]

Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9999. Modellen beskriver målingerne godt.

Top A er methanol og har arealet 977. Arealet ligger mellem den mindste og den største standard. Koncentrationen i den fortyndede spiritus er

\[ c(\mathrm{methanol}) = \frac{977 - 3{,}7}{412{,}5\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{g}}} = 2{,}36\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}} \]

Spiritussen er fortyndet 50 gange:

\[ c(\text{spiritus}) = 50 \cdot 2{,}36\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}} = 118\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}} \]

Spiritussen indeholder 118 g methanol pr. liter.

  1. Det volumen spiritus, der indeholder 8 g methanol, er

\[ V = \frac{m}{c} = \frac{8\ \mathrm{g}}{118\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}}} = 0{,}068\ \mathrm{L} \]

Det er 68 mL. Et lille glas spiritus er på 4 cL = 0,040 L og indeholder

\[ m(\mathrm{methanol}) = c \cdot V = 118\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}040\ \mathrm{L} = 4{,}7\ \mathrm{g} \]

En person kan altså højst drikke omkring 68 mL af spiritussen, før der er fare for varige skader på synet. Det er mindre end to små glas. Vurderingen er usikker, fordi grænsen på 8 g er et rundt tal, og fordi mennesker tåler methanol forskelligt. Spiritussen indeholder så meget methanol, at den slet ikke bør drikkes.

Opgave A6.5.eks.3: Ægte vanilje?

Vanillin giver vanilje sin smag. Ægte vaniljestænger er dyre og indeholder omkring 2 g vanillin pr. 100 g. Billige varer får derfor ofte smag af vanillin, der er lavet på en fabrik, eller af ethylvanillin. Ethylvanillin findes ikke i naturen og smager kraftigere end vanillin.

På en pose vaniljesukker står der: “Med 5 % ægte vanilje. Uden tilsatte aromastoffer.” Et laboratorium undersøger vaniljesukkeret med HPLC med omvendt fase. 2,00 g vaniljesukker opløses i vand, og opløsningen fyldes op til 100,0 mL. Den kaldes opløsning A. Opløsning A fortyndes 10 gange til opløsning B, som køres på HPLC. Figuren viser vanillin og ethylvanillin og chromatogrammet af opløsning B. Arealet under hver top står over toppen.

Figur 8: Vanillin og ethylvanillin og chromatogrammet af opløsning B af vaniljesukkeret.

Standarder af de to stoffer er kørt under de samme betingelser som opløsning B.

Standard log P Retentionstid
vanillin 1,2 3,2 min
ethylvanillin 1,6 4,9 min

Til standardkurven er der kørt fem standarder med vanillin.

c(vanillin) i mg/L 5 10 15 20 25
Areal 240 473 722 951 1200
  1. Angiv de funktionelle grupper i vanillin.
  2. Forklar ud fra de to stoffers opbygning, at ethylvanillin har en længere retentionstid end vanillin.
  3. Bestem indholdet af vanillin i vaniljesukkeret i gram pr. 100 g.
  4. Vurdér ud fra chromatogrammet og resultatet i spørgsmål c, om oplysningerne på posen kan være rigtige.

Find de tre grupper med oxygen i strukturformlen for vanillin. Til spørgsmål b: Find forskellen på vanillin og ethylvanillin, og husk, at den stationære fase er upolær i omvendt fase. Til spørgsmål c: Lav lineær regression på de fem standarder med vanillin, og regn tilbage fra opløsning B til opløsning A og til de 2,00 g vaniljesukker.

Top A i chromatogrammet af opløsning B har retentionstiden 3,2 min ligesom standarden med vanillin, og arealet er 602. Regressionen for vanillin giver hældningen 47,96 L/mg og skæringen −2,2. Opløsning A er 10 gange så koncentreret som opløsning B, og massen af vanillin i de 100,0 mL = 0,1000 L af opløsning A er m = c · V. Den masse kommer fra 2,00 g vaniljesukker.

Til spørgsmål d: Beregn, hvor meget vanillin 5 g ægte vanilje højst kan give, og se på, hvad top B i chromatogrammet er. Du kan begynde sådan: “Top B har samme retentionstid som …, og det stof … 100 g vaniljesukker med 5 % vanilje indeholder … g vanilje, som højst kan give …”

  1. Vanillin har tre funktionelle grupper: en hydroxygruppe, som sidder på benzenringen, en ethergruppe, C−O−C, og en aldehydgruppe, −CHO.

  2. Vanillin og ethylvanillin har de samme tre polære grupper. Den eneste forskel er ethergruppen: i vanillin sidder der en methylgruppe på oxygenatomet, og i ethylvanillin sidder der en ethylgruppe. Ethylvanillin har altså ét carbonatom mere og dermed en større upolær del. Det ses også på log P, som er 1,6 for ethylvanillin og 1,2 for vanillin.

I HPLC med omvendt fase er den stationære fase upolær, og den mobile fase er polær. Ethylvanillin er det mest upolære af de to stoffer og bindes stærkest til carbonkæderne i den stationære fase med londonbindinger. Ethylvanillin holdes derfor længst tilbage og får den længste retentionstid.

  1. Arealet af en top er proportionalt med koncentrationen, så sammenhængen mellem areal og koncentration er lineær:

\[ \text{areal} = a \cdot c(\mathrm{vanillin}) + b \]

Arealet afbildes som funktion af koncentrationen for de fem standarder.

Figur 9: Standardkurven for vanillin med den bedste rette linje.

Lineær regression giver modellen

\[ \text{areal} = 47{,}96\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}} \cdot c(\mathrm{vanillin}) - 2{,}2 \]

Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9998. Modellen beskriver målingerne godt.

Top A har samme retentionstid som standarden med vanillin, 3,2 min, og arealet er 602. Arealet ligger mellem den mindste og den største standard. Koncentrationen i opløsning B er

\[ c(\mathrm{vanillin}) = \frac{602 - (-2{,}2)}{47{,}96\ \dfrac{\mathrm{L}}{\mathrm{mg}}} = 12{,}6\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

Opløsning A er 10 gange så koncentreret som opløsning B:

\[ c(\text{opløsning A}) = 10 \cdot 12{,}6\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} = 126\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \]

Opløsning A fylder 100,0 mL = 0,1000 L:

\[ m(\mathrm{vanillin}) = c \cdot V = 126\ \dfrac{\mathrm{mg}}{\mathrm{L}} \cdot 0{,}1000\ \mathrm{L} = 12{,}6\ \mathrm{mg} \]

De 12,6 mg vanillin kommer fra 2,00 g vaniljesukker. I 100 g vaniljesukker er der

\[ m(\text{vanillin i 100 g}) = \frac{12{,}6\ \mathrm{mg}}{2{,}00\ \mathrm{g}} \cdot 100\ \mathrm{g} = 630\ \mathrm{mg} \]

Vaniljesukkeret indeholder 0,63 g vanillin pr. 100 g.

  1. Oplysningerne på posen kan ikke være rigtige. Det viser to ting.

Top B har retentionstiden 4,9 min ligesom standarden med ethylvanillin. Vaniljesukkeret indeholder altså sandsynligvis ethylvanillin. Ethylvanillin findes ikke i naturen, så det må være tilsat som aromastof.

100 g vaniljesukker med 5 % ægte vanilje indeholder 5 g vanilje. Vaniljestænger indeholder omkring 2 g vanillin pr. 100 g, så vaniljen kan højst give

\[ m(\mathrm{vanillin}) = 5\ \mathrm{g} \cdot \frac{2\ \mathrm{g}}{100\ \mathrm{g}} = 0{,}10\ \mathrm{g} \]

Målingen viser 0,63 g vanillin pr. 100 g, altså omkring seks gange så meget. Det meste af vanillinen må derfor også være tilsat.

To forskellige stoffer kan have samme retentionstid. Laboratoriet kan blive mere sikkert ved at tilsætte lidt ethylvanillin til opløsning B og køre den igen. Bliver top B højere uden at blive til to toppe, er det ethylvanillin.