A7.4 Når DNA smelter
Supplerende stof
Varmer man en opløsning af DNA op, går de to strenge fra hinanden. Køler man den ned igen, finder de sammen. Det kaldes, at DNA smelter, selv om intet bliver flydende. Det er en ligevægt, og den opfører sig præcis, som termodynamikken i kapitel A2 forudsiger.
En ligevægt mellem to former
Når de to strenge skilles, sker der to ting:
- ΔH er positiv. Hydrogenbindingerne mellem baserne og londonbindingerne mellem de stablede basepar skal brydes. Det kræver energi, så processen er endoterm.
- ΔS er positiv. To frie strenge, der kan bøje og dreje sig, har mere uorden end én stiv dobbeltspiral.
Det er kombinationen fra tabellen i afsnit A2.4, hvor temperaturen afgør udfaldet:
\[ \Delta G = \Delta H - T \cdot \Delta S \]
Størrelserne er standardværdierne ΔG⊖, ΔH⊖ og ΔS⊖ fra kapitel A2. Mærket ⊖ er udeladt i dette afsnit, så formlerne er lettere at læse.
Ved lav temperatur vinder ΔH, ΔG er positiv, og DNA bliver sammen som dobbeltstreng. Ved høj temperatur vinder leddet med ΔS, ΔG bliver negativ, og strengene skilles.
Smeltetemperaturen
Den temperatur, hvor halvdelen af DNA’et er smeltet, kaldes smeltetemperaturen, Tm.
Regnestykket er enklest for en hårnål: en enkelt streng, hvis to ender er komplementære, så den folder sig sammen med sig selv. Den kan være foldet eller udfoldet, og ligevægtskonstanten er K = [udfoldet] / [foldet]. Ved smeltetemperaturen er der lige meget af de to former, så K = 1 og ΔG = 0:
\[ \Delta G = \Delta H - T_\mathrm{m} \cdot \Delta S = 0 \qquad\text{og dermed}\qquad T_\mathrm{m} = \frac{\Delta H}{\Delta S} \]
For to adskilte strenge afhænger smeltetemperaturen også af koncentrationen, fordi de to strenge skal finde hinanden. Men princippet er det samme.
Smeltekurven
Smeltningen kan følges med et spektrofotometer. Baserne absorberer ultraviolet lys med en bølgelængde på 260 nm. Når baserne ligger stablet i dobbeltspiralen, absorberer de mindre, end når de er frie. Absorbansen stiger derfor med omkring 37 %, når DNA smelter.
Smeltetemperaturen aflæses dér, hvor absorbansen har nået halvdelen af sin stigning. Kurven er stejl, fordi baseparrene hjælper hinanden: når først nogle par er gået op, slipper naboerne lettere.
G og C holder bedst
Smeltetemperaturen afhænger af, hvor mange af baseparrene der er G og C.
Lineær regression giver modellen
\[ T_\mathrm{m} = 0{,}410\ \mathrm{°C} \cdot p + 69{,}3\ \mathrm{°C} \]
hvor p er indholdet af G og C i procent. Punkterne ligger tæt på linjen og tilfældigt omkring den, og r2 = 0,9986.
Forklaringen er baseparrene fra afsnit A7.3. Et par af G og C holdes sammen af 3 hydrogenbindinger, et par af A og T kun af 2. Jo flere par af G og C, jo større er ΔH, og jo højere er smeltetemperaturen. For DNA med 50 % G og C giver modellen Tm = 0,410 °C · 50 + 69,3 °C = 89,8 °C.
To andre ting flytter også smeltetemperaturen:
- Salt. Positive ioner som Na+ lægger sig om phosphatgrupperne og dæmper frastødningen mellem de to negativt ladede strenge. Mere salt giver en højere smeltetemperatur.
- pH. Over pH 12 afgiver N−H-grupperne i thymin og guanin deres hydron. Så kan de ikke længere give en hydrogenbinding, og strengene skilles, selv ved stuetemperatur.
Hvor meget DNA er der?
Absorbansen ved 260 nm bruges også til at måle koncentrationen af DNA. Det følger Lambert-Beers lov fra afsnit B5.3, og i laboratoriet bruger man en fast omregning:
| Absorbans ved 260 nm i en kuvette på 1 cm | Koncentration af dobbeltstrenget DNA |
|---|---|
| 1,00 | 50 µg/mL |
- Kan du afgøre fortegnet for ΔH og ΔS for en reaktion i kapitel A2, kan du også gøre det for et stort molekyle, der folder sig ud: bindinger brydes, og uordenen stiger.
- Skal du finde den temperatur, hvor en proces skifter retning, så sæt ΔG = 0 og løs for T. Husk at regne ΔH og ΔS om til samme energienhed.
- En ret linje gennem målepunkter behandles altid på samme måde: graf med punkter og linje, model med symboler og enheder, og en vurdering.