Opgaver til A7.4

Opgaverne hører til afsnit A7.4 Når DNA smelter. Prøv selv, før du åbner hjælpen under opgaven. Kapitel A7 er et temakapitel uden for kernestoffet, og opgaverne bruger kernestof fra resten af bogen på DNA.

Opgave A7.4.1: To strenge går fra hinanden

Varmer man en opløsning af DNA op, går de to strenge i dobbeltspiralen fra hinanden. Køler man opløsningen ned, finder de sammen igen. Det er en ligevægt:

dobbeltstrenget DNA ⇌ enkeltstreng + enkeltstreng

  1. Hvilke to slags bindinger holder de to strenge i dobbeltstrenget DNA sammen?
  2. Er ΔH positiv eller negativ, når de to strenge skilles? Begrund svaret med bindingerne.
  3. Er ΔS positiv eller negativ, når de to strenge skilles? Begrund svaret med uorden.
  4. Er det endotermt eller exotermt at skille de to strenge i DNA?
  5. Hvilke fortegn har ΔH og ΔS for den modsatte proces, hvor to enkeltstrenge finder sammen til dobbeltstrenget DNA?

Læs reaktionsskemaet for smeltningen af DNA fra venstre mod højre, og stil to spørgsmål: Bliver der brudt bindinger, eller bliver der dannet bindinger? Bliver der mere eller mindre uorden? Det koster energi at bryde bindinger, og mere uorden betyder større entropi.

Baserne i de to strenge i DNA sidder sammen to og to i basepar, og baseparrene ligger stablet oven på hinanden.

Du kan begynde sådan: “Når de to strenge i DNA skilles, skal … brydes. Det kræver energi, så ΔH er …” og “To frie strenge kan …, mens dobbeltspiralen er … Uordenen bliver derfor …, og ΔS er …”

Den modsatte proces har de modsatte fortegn.

  1. De to strenge i dobbeltstrenget DNA holdes sammen af hydrogenbindinger mellem baserne i hvert basepar og af londonbindinger mellem de stablede basepar.

  2. ΔH er positiv. Når de to strenge i DNA skilles, skal hydrogenbindingerne mellem baserne og londonbindingerne mellem de stablede basepar brydes, og det kræver energi.

  3. ΔS er positiv. To frie strenge, der kan bøje og dreje sig, har mere uorden end én stiv dobbeltspiral. Entropien stiger altså, når DNA smelter.

  4. Det er endotermt at skille de to strenge i DNA, fordi ΔH er positiv.

  5. Når to enkeltstrenge finder sammen til dobbeltstrenget DNA, er både ΔH og ΔS negative. Der bliver dannet hydrogenbindinger og londonbindinger, så der afgives energi, og to frie strenge bliver til én stiv dobbeltspiral, så uordenen bliver mindre.

Opgave A7.4.2: Foldet eller udfoldet?

En hårnål er en enkelt streng af DNA, hvis to ender er komplementære. Strengen kan derfor folde sig sammen med sig selv, som figuren viser.

Figur 1: En hårnål af DNA kan være foldet eller udfoldet.

For udfoldningen af en bestemt hårnål er ΔH = 150 kJ/mol og ΔS = 460 J/(mol · K).

  1. Regn ΔS for udfoldningen om til kJ/(mol · K).
  2. Beregn ΔG for udfoldningen ved 25 °C.
  3. Beregn ΔG for udfoldningen ved 80 °C.
  4. Afgør for hver af de to temperaturer, om hårnålen er foldet eller udfoldet.

Brug formlen ΔG = ΔH − T · ΔS fra afsnit A7.4 på udfoldningen af hårnålen. Temperaturen skal stå i kelvin, og ΔH og ΔS skal have samme energienhed. Du regner ΔS om fra J til kJ ved at dele med 1000.

For hårnålen er ΔS = 0,460 kJ/(mol · K). Ved 25 °C er T = (273 + 25) K = 298 K, og ved 80 °C er T = (273 + 80) K = 353 K.

Er ΔG for udfoldningen positiv, er udfoldningen ikke spontan, og hårnålen bliver ved med at være foldet. Er ΔG negativ, folder hårnålen sig ud.

  1. ΔS = 460 J/(mol · K) = 0,460 kJ/(mol · K).

  2. Temperaturen er T = (273 + 25) K = 298 K.

\[ \Delta G = \Delta H - T \cdot \Delta S = 150\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} - 298\ \mathrm{K} \cdot 0{,}460\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol \cdot K}} = 12{,}9\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} \]

  1. Temperaturen er T = (273 + 80) K = 353 K.

\[ \Delta G = 150\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} - 353\ \mathrm{K} \cdot 0{,}460\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol \cdot K}} = -12{,}4\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} \]

  1. Ved 25 °C er ΔG for udfoldningen positiv. Udfoldningen er ikke spontan, så hårnålen er foldet. Ved 80 °C er ΔG negativ. Udfoldningen er spontan, så hårnålen er udfoldet. Det passer med, at både ΔH og ΔS er positive: så er det den høje temperatur, der får leddet med ΔS til at vinde.

Opgave A7.4.3: Smeltetemperaturen for to hårnåle

Smeltetemperaturen, Tm, for en hårnål af DNA er den temperatur, hvor halvdelen af hårnålene er udfoldet. Ved smeltetemperaturen er ΔG = 0 for udfoldningen. Tabellen viser ΔH og ΔS for udfoldningen af to hårnåle.

Hårnål ΔH i kJ/mol ΔS i J/(mol · K)
A 126 375
B 245 700
  1. Beregn smeltetemperaturen for hårnål A i kelvin og i grader celsius.
  2. Beregn smeltetemperaturen for hårnål B i kelvin og i grader celsius.
  3. Afgør for hver af de to hårnåle, om den er foldet eller udfoldet ved 70 °C.
  4. Den foldede del af hårnål B har flere basepar end den foldede del af hårnål A. Forklar, hvordan det passer med de to værdier af ΔH.

Sæt ΔG = 0 i formlen ΔG = ΔH − T · ΔS for udfoldningen af hårnålen. Så får du Tm = ΔH / ΔS. Regn først ΔH om fra kJ/mol til J/mol, så de to størrelser har samme energienhed.

For hårnål A er ΔH = 126 kJ/mol = 126 000 J/mol. Formlen giver smeltetemperaturen i kelvin, og du finder temperaturen i grader celsius ved at trække 273 fra.

Under smeltetemperaturen er en hårnål foldet, og over smeltetemperaturen er den udfoldet.

Du kan begynde forklaringen sådan: “Hvert basepar i den foldede del holdes sammen af … Når hårnål B folder sig ud, skal der derfor brydes … end i hårnål A, og ΔH er …”

  1. For hårnål A er ΔH = 126 kJ/mol = 126 000 J/mol.

\[ T_\mathrm{m} = \frac{\Delta H}{\Delta S} = \frac{126\,000\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}}}{375\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}}} = 336\ \mathrm{K} \]

Smeltetemperaturen for hårnål A er 336 K. Det svarer til 63 °C.

  1. For hårnål B er ΔH = 245 kJ/mol = 245 000 J/mol.

\[ T_\mathrm{m} = \frac{\Delta H}{\Delta S} = \frac{245\,000\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}}}{700\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}}} = 350\ \mathrm{K} \]

Smeltetemperaturen for hårnål B er 350 K. Det svarer til 77 °C.

  1. Ved 70 °C er temperaturen over smeltetemperaturen for hårnål A, som er 63 °C, så hårnål A er udfoldet. Temperaturen er under smeltetemperaturen for hårnål B, som er 77 °C, så hårnål B er foldet.

Det kan kontrolleres med ΔG ved T = (273 + 70) K = 343 K. For hårnål A er ΔG = 126 kJ/mol − 343 K · 0,375 kJ/(mol · K) = −2,6 kJ/mol, og for hårnål B er ΔG = 245 kJ/mol − 343 K · 0,700 kJ/(mol · K) = 4,9 kJ/mol.

  1. Hvert basepar i den foldede del af en hårnål holdes sammen af hydrogenbindinger, og baseparrene holdes stablet af londonbindinger. Hårnål B har flere basepar, så der skal brydes flere bindinger, når den folder sig ud. Det kræver mere energi, og derfor er ΔH større for hårnål B end for hårnål A.

Opgave A7.4.4: Aflæs en smeltekurve

En opløsning af DNA varmes langsomt op i et spektrofotometer, mens absorbansen ved 260 nm måles. Figuren viser smeltekurven for DNA’et.

Figur 2: Smeltekurve for en opløsning af DNA.
  1. Aflæs absorbansen, før DNA’et begynder at smelte, og absorbansen, når alt DNA’et er smeltet.
  2. Beregn, hvor mange procent absorbansen stiger, når DNA’et smelter.
  3. Beregn den absorbans, hvor halvdelen af stigningen er nået.
  4. Aflæs smeltetemperaturen for DNA’et.
  5. Forklar, hvorfor absorbansen ved 260 nm stiger, når DNA smelter.

Smeltekurven for DNA’et er flad i begge ender. Det flade stykke til venstre viser absorbansen af dobbeltstrenget DNA, og det flade stykke til højre viser absorbansen af enkeltstrenget DNA. Smeltetemperaturen er den temperatur, hvor absorbansen har nået halvdelen af sin stigning.

Absorbansen stiger fra 0,60 til 0,82, når DNA’et smelter. Stigningen i procent er stigningen delt med startværdien og ganget med 100 %. Halvdelen af stigningen er nået ved den absorbans, der ligger midt mellem 0,60 og 0,82. Gå vandret ud fra den absorbans til kurven og lodret ned til temperaturaksen.

Du kan begynde forklaringen sådan: “Det er … i DNA, der absorberer lys ved 260 nm. I dobbeltspiralen ligger de …, og så absorberer de … Når strengene skilles, …”

  1. Før DNA’et begynder at smelte, er absorbansen 0,60. Når alt DNA’et er smeltet, er absorbansen 0,82.

  2. Absorbansen stiger fra 0,60 til 0,82, altså med 0,22.

\[ \text{stigning} = \frac{0{,}22}{0{,}60} \cdot 100\ \% = 37\ \% \]

Absorbansen stiger med 37 %, når DNA’et smelter.

  1. Halvdelen af stigningen er nået ved absorbansen

\[ A = 0{,}60 + \frac{0{,}22}{2} = 0{,}71 \]

  1. Kurven når absorbansen 0,71 ved 82 °C, så smeltetemperaturen for DNA’et er Tm = 82 °C.
Figur 3: Smeltetemperaturen aflæses, hvor absorbansen har nået halvdelen af sin stigning.
  1. Det er baserne i DNA, der absorberer ultraviolet lys med bølgelængden 260 nm. I dobbeltspiralen ligger baserne stablet oven på hinanden, og stablede baser absorberer mindre lys end frie baser. Når de to strenge skilles, ligger baserne ikke længere stablet på samme måde, og derfor stiger absorbansen.

Opgave A7.4.5: G og C holder bedst

For lange stykker DNA afhænger smeltetemperaturen af, hvor mange af baseparrene der er G og C. Afsnit A7.4 giver modellen

\[ T_\mathrm{m} = 0{,}410\ \mathrm{°C} \cdot p + 69{,}3\ \mathrm{°C} \]

hvor p er indholdet af G og C i procent.

  1. Hvor mange hydrogenbindinger holder et basepar af G og C sammen, og hvor mange holder et basepar af A og T sammen?
  2. Forklar, hvorfor DNA med meget G og C smelter ved en højere temperatur end DNA med lidt G og C.
  3. Beregn smeltetemperaturen for DNA med 38 % G og C.
  4. Et stykke DNA har smeltetemperaturen 95,0 °C. Beregn indholdet af G og C i DNA’et.
  5. I et andet stykke dobbeltstrenget DNA er 21 % af baserne adenin. Beregn indholdet af G og C, og beregn smeltetemperaturen for DNA’et.

Baseparrene i DNA står i afsnit A7.3. I spørgsmål c sætter du p = 38 ind i modellen for smeltetemperaturen. I spørgsmål d kender du Tm og skal løse modellen for p.

Modellen for smeltetemperaturen løses for p ved først at trække 69,3 °C fra på begge sider og derefter dele med 0,410 °C.

I dobbeltstrenget DNA sidder A altid over for T, så der er lige meget adenin og thymin. Resten af baserne er guanin og cytosin.

Du kan begynde forklaringen sådan: “Et basepar af G og C holdes sammen af …, mens et basepar af A og T … Jo flere basepar af G og C, jo … energi kræver det at skille strengene, så ΔH er …, og smeltetemperaturen er …”

  1. Et basepar af G og C holdes sammen af 3 hydrogenbindinger. Et basepar af A og T holdes sammen af 2 hydrogenbindinger.

  2. Et basepar af G og C har 3 hydrogenbindinger, mens et basepar af A og T kun har 2. Jo flere basepar af G og C der er i DNA’et, jo mere energi kræver det at skille de to strenge. ΔH for smeltningen er altså større, og så skal temperaturen højere op, før leddet T · ΔS er lige så stort som ΔH. Derfor er smeltetemperaturen højere.

  3. For DNA med 38 % G og C er p = 38.

\[ T_\mathrm{m} = 0{,}410\ \mathrm{°C} \cdot 38 + 69{,}3\ \mathrm{°C} = 84{,}9\ \mathrm{°C} \]

  1. Modellen løses for p, og Tm = 95,0 °C sættes ind:

\[ p = \frac{T_\mathrm{m} - 69{,}3\ \mathrm{°C}}{0{,}410\ \mathrm{°C}} = \frac{95{,}0\ \mathrm{°C} - 69{,}3\ \mathrm{°C}}{0{,}410\ \mathrm{°C}} = 62{,}7 \]

DNA’et indeholder 62,7 % G og C.

  1. I dobbeltstrenget DNA sidder A altid over for T, så der er lige så meget thymin som adenin. Adenin og thymin udgør 21 % hver, altså 42 % af baserne tilsammen. Resten er G og C:

\[ p = 100 - 42 = 58 \]

\[ T_\mathrm{m} = 0{,}410\ \mathrm{°C} \cdot 58 + 69{,}3\ \mathrm{°C} = 93{,}1\ \mathrm{°C} \]

DNA’et indeholder 58 % G og C, og smeltetemperaturen er 93,1 °C.

Opgave A7.4.6: Hvor meget DNA er der?

Koncentrationen af DNA i en opløsning kan bestemmes med et spektrofotometer. I en kuvette med lysvejen 1,00 cm svarer en absorbans på 1,00 ved 260 nm til 50 µg dobbeltstrenget DNA pr. mL.

  1. En opløsning af dobbeltstrenget DNA har absorbansen 0,24 ved 260 nm. Beregn koncentrationen af DNA i µg/mL.
  2. En anden opløsning af dobbeltstrenget DNA er for koncentreret til at blive målt direkte. Derfor fortyndes 0,100 mL af opløsningen til 2,00 mL. Den fortyndede opløsning har absorbansen 0,57 ved 260 nm. Beregn koncentrationen af DNA i opløsningen før fortyndingen.
  3. Forklar, hvorfor en opløsning med meget DNA skal fortyndes, før absorbansen måles.
  4. Regnes koncentrationen som stofmængdekoncentrationen af nucleotider, er ekstinktionskoefficienten for dobbeltstrenget DNA 6600 M−1 · cm−1 ved 260 nm. Et nucleotid i DNA har i gennemsnit molarmassen 330 g/mol. En opløsning af dobbeltstrenget DNA har absorbansen 0,33 i en kuvette med lysvejen 1,00 cm. Beregn koncentrationen af nucleotider med Lambert-Beers lov, regn den om til µg DNA pr. mL, og sammenlign med den faste omregning på 50 µg/mL.

Absorbansen er proportional med koncentrationen af DNA. En opløsning med absorbansen 0,24 indeholder derfor 0,24 gange så meget DNA som en opløsning med absorbansen 1,00. I spørgsmål b finder du først koncentrationen i den fortyndede opløsning og regner derefter tilbage med fortyndingsformlen fra afsnit B5.4.

Opløsningen af DNA bliver fortyndet fra 0,100 mL til 2,00 mL, altså 20 gange. Koncentrationen før fortyndingen er derfor 20 gange så stor som koncentrationen i den fortyndede opløsning.

I spørgsmål d løses Lambert-Beers lov for koncentrationen: c = A / (ε · \(l\)). Massen af DNA i 1 liter er c · M, og 1 mg/L er det samme som 1 µg/mL.

Du kan begynde forklaringen sådan: “Lambert-Beers lov gælder kun for … Er absorbansen højere end …, slipper der … lys gennem kuvetten, og …”

  1. Absorbansen er proportional med koncentrationen af DNA:

\[ c = \frac{0{,}24}{1{,}00} \cdot 50\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} = 12\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Opløsningen indeholder 12 µg DNA pr. mL.

  1. Koncentrationen af DNA i den fortyndede opløsning er

\[ c_{\text{efter}} = \frac{0{,}57}{1{,}00} \cdot 50\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} = 28{,}5\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Fortyndingsformlen giver koncentrationen før fortyndingen:

\[ c_{\text{før}} = \frac{c_{\text{efter}} \cdot V_{\text{efter}}}{V_{\text{før}}} = \frac{28{,}5\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \cdot 2{,}00\ \mathrm{mL}}{0{,}100\ \mathrm{mL}} = 570\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Opløsningen indeholder 570 µg DNA pr. mL før fortyndingen, altså 0,57 mg/mL.

  1. Lambert-Beers lov gælder kun for fortyndede opløsninger, og absorbansen skal helst være under 1. Ved en højere absorbans slipper der meget lidt lys gennem kuvetten. Så bliver målingen usikker, og absorbansen er ikke længere proportional med koncentrationen af DNA. En opløsning med meget DNA fortyndes derfor, til absorbansen er under 1, og bagefter regner man tilbage til den oprindelige opløsning.

  2. Lambert-Beers lov løses for koncentrationen af nucleotider:

\[ c = \frac{A}{\varepsilon \cdot l} = \frac{0{,}33}{6600\ \mathrm{M^{-1} \cdot cm^{-1}} \cdot 1{,}00\ \mathrm{cm}} = 5{,}0 \cdot 10^{-5}\ \mathrm{M} \]

Massen af DNA i 1 liter opløsning er

\[ \text{masse pr. liter} = 5{,}0 \cdot 10^{-5}\ \dfrac{\mathrm{mol}}{\mathrm{L}} \cdot 330\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{mol}} = 0{,}0165\ \dfrac{\mathrm{g}}{\mathrm{L}} \]

Det er 16,5 mg/L, og det er det samme som 16,5 µg/mL. Den faste omregning giver

\[ c = \frac{0{,}33}{1{,}00} \cdot 50\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} = 16{,}5\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

De to beregninger giver det samme. Den faste omregning på 50 µg/mL er altså Lambert-Beers lov for dobbeltstrenget DNA, skrevet med massen af DNA i stedet for stofmængden af nucleotider.

Opgave A7.4.7: Salt og høj pH

To ting ud over temperaturen afgør, om de to strenge i DNA holder sammen: hvor meget salt der er i opløsningen, og hvilken pH opløsningen har. Rygraden i hver streng har en phosphatgruppe for hvert nucleotid, og ved pH 7 har hver phosphatgruppe en negativ ladning.

Figuren viser baseparret af adenin og thymin. Den ene af de to hydrogenbindinger i baseparret går fra N−H-gruppen i thymin til et nitrogenatom i adenin. N−H-gruppen i thymin er en meget svag syre. Regn med pKs = 9,9.

Figur 4: Baseparret af adenin og thymin med N−H-gruppen i thymin fremhævet.
  1. Forklar, hvorfor de to strenge i dobbeltstrenget DNA frastøder hinanden.
  2. Den samme slags DNA opløses i 0,010 M NaCl og i 0,50 M NaCl. Afgør, i hvilken af de to opløsninger DNA’et har den højeste smeltetemperatur, og forklar hvorfor.
  3. Beregn syrebrøken for N−H-gruppen i thymin ved pH 7,0 og ved pH 12,5.
  4. Forklar ud fra de to syrebrøker, hvorfor de to strenge i DNA skilles ved pH 12,5, selv ved stuetemperatur.

Ens ladninger frastøder hinanden, og modsatte ladninger tiltrækker hinanden. Tænk på, hvad de positive ioner Na+ fra saltet gør ved de negative phosphatgrupper i DNA. Syrebrøken beregnes med formlen fra afsnit A1.7.

Syrebrøken for N−H-gruppen i thymin er

\[ x_\mathrm{s} = \frac{1}{1 + 10^{\,\mathrm{pH} - \mathrm{p}K_\mathrm{s}}} \]

Syreformen er den, hvor hydrogenatomet sidder på nitrogenatomet. Kun syreformen kan give et hydrogenatom til en hydrogenbinding.

Du kan begynde forklaringen om salt sådan: “Ionerne Na+ lægger sig om … og dæmper … I opløsningen med mest salt …, og derfor …”

Du kan begynde forklaringen om pH sådan: “Ved pH 12,5 er næsten alle N−H-grupperne i thymin på … Så mangler …, og thymin kan ikke længere …”

  1. Hver phosphatgruppe i rygraden har en negativ ladning ved pH 7, så begge strenge i DNA er negativt ladede hele vejen. Ens ladninger frastøder hinanden, og derfor frastøder de to strenge hinanden.

  2. DNA’et har den højeste smeltetemperatur i 0,50 M NaCl. De positive ioner Na+ tiltrækkes af de negative phosphatgrupper og lægger sig om dem. Det dæmper frastødningen mellem de to negativt ladede strenge. I opløsningen med 0,50 M NaCl er der flest ioner til at dæmpe frastødningen, så strengene holder bedre sammen, og der skal en højere temperatur til at skille dem.

  3. Ved pH 7,0 er syrebrøken for N−H-gruppen i thymin

\[ x_\mathrm{s} = \frac{1}{1 + 10^{\,7{,}0 - 9{,}9}} = 0{,}999 \]

Ved pH 12,5 er syrebrøken for N−H-gruppen i thymin

\[ x_\mathrm{s} = \frac{1}{1 + 10^{\,12{,}5 - 9{,}9}} = 0{,}0025 \]

  1. Ved pH 7,0 er 99,9 % af N−H-grupperne i thymin på syreformen. Hydrogenatomet sidder på nitrogenatomet, og gruppen kan give det til en hydrogenbinding til adenin. Ved pH 12,5 er kun 0,25 % af grupperne på syreformen. Resten har afgivet deres hydron, så nitrogenatomet har en negativ ladning og intet hydrogenatom. Så kan thymin ikke længere give en hydrogenbinding til adenin. N−H-gruppen i guanin afgiver sin hydron på samme måde. Baseparrene mister derfor hydrogenbindinger, og de to strenge skilles, selv ved stuetemperatur.

Opgave A7.4.8: Hvor stor en del er udfoldet?

En hårnål er en enkelt streng af DNA, som er foldet sammen med sig selv. Den foldede og den udfoldede form er i ligevægt:

foldet hårnål ⇌ udfoldet hårnål

Ligevægtskonstanten er K = [udfoldet] / [foldet]. For udfoldningen af en bestemt hårnål er ΔH⊖ = 170 kJ/mol og ΔS⊖ = 500 J/(mol · K). Afsnit A7.4 skriver ΔH, ΔS og ΔG uden standardtegn. Værdierne gælder ved standardtilstand, og derfor står de her med standardtegn som i kapitel A2.

  1. Beregn ΔG⊖ for udfoldningen ved 57 °C.
  2. Beregn ligevægtskonstanten for udfoldningen ved 57 °C.
  3. Beregn, hvor stor en del af hårnålene der er udfoldet ved 57 °C.
  4. Beregn, hvor stor en del af hårnålene der er udfoldet ved 77 °C.
  5. Beregn hårnålens smeltetemperatur, og angiv ligevægtskonstanten ved smeltetemperaturen.

Beregn først ΔG⊖ = ΔH⊖ − T · ΔS⊖ for udfoldningen af hårnålen. Ligevægtskonstanten findes derefter med formlen fra afsnit A2.5: ΔG⊖ = −R · T · ln K. Husk, at ΔG⊖ og R skal have samme energienhed.

Ved 57 °C er T = (273 + 57) K = 330 K, og ΔG⊖ for udfoldningen af hårnålen er 5,0 kJ/mol = 5000 J/mol. Brug ln K = −ΔG⊖ / (R · T) med R = 8,314 J/(mol · K).

x angiver her den del af hårnålene, der er udfoldet. Så er delen 1 − x foldet, og K = x / (1 − x). Løs ligningen for x.

Ved smeltetemperaturen er halvdelen af hårnålene udfoldet, så [udfoldet] = [foldet].

  1. Temperaturen er T = (273 + 57) K = 330 K, og ΔS⊖ = 500 J/(mol · K) = 0,500 kJ/(mol · K).

\[ \Delta G^{\ominus} = \Delta H^{\ominus} - T \cdot \Delta S^{\ominus} = 170\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} - 330\ \mathrm{K} \cdot 0{,}500\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol \cdot K}} = 5{,}0\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} \]

  1. ΔG⊖ regnes om til joule, så enheden passer med gaskonstanten: 5,0 kJ/mol = 5000 J/mol.

\[ \ln K = -\frac{\Delta G^{\ominus}}{R \cdot T} = -\frac{5000\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}}}{8{,}314\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}} \cdot 330\ \mathrm{K}} = -1{,}822 \]

\[ K = e^{-1{,}822} = 0{,}162 \]

Ligevægtskonstanten for udfoldningen er 0,162 ved 57 °C. Den har ingen enhed, fordi der står en koncentration både over og under brøkstregen.

  1. x angiver her den del af hårnålene, der er udfoldet. Så er delen 1 − x foldet, og ligevægtsloven giver

\[ K = \frac{x}{1 - x} \]

Ligningen løses for x:

\[ x = K \cdot (1 - x) \qquad\Rightarrow\qquad x + K \cdot x = K \qquad\Rightarrow\qquad x = \frac{K}{1 + K} \]

\[ x = \frac{0{,}162}{1 + 0{,}162} = 0{,}139 \]

Ved 57 °C er 14 % af hårnålene udfoldet.

  1. Temperaturen er T = (273 + 77) K = 350 K.

\[ \Delta G^{\ominus} = 170\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} - 350\ \mathrm{K} \cdot 0{,}500\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol \cdot K}} = -5{,}0\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}} \]

\[ \ln K = -\frac{-5000\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}}}{8{,}314\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}} \cdot 350\ \mathrm{K}} = 1{,}718 \]

\[ K = e^{1{,}718} = 5{,}57 \]

x angiver her den del af hårnålene, der er udfoldet ved 77 °C:

\[ x = \frac{K}{1 + K} = \frac{5{,}57}{1 + 5{,}57} = 0{,}848 \]

Ved 77 °C er 85 % af hårnålene udfoldet.

  1. Ved smeltetemperaturen er ΔG⊖ = 0 for udfoldningen af hårnålen:

\[ T_\mathrm{m} = \frac{\Delta H^{\ominus}}{\Delta S^{\ominus}} = \frac{170\,000\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}}}{500\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}}} = 340\ \mathrm{K} \]

Smeltetemperaturen er 340 K, og det svarer til 67 °C. Når ΔG⊖ = 0, er ln K = 0, og så er K = 1. Det passer med, at halvdelen af hårnålene er udfoldet ved smeltetemperaturen: 57 °C ligger 10 grader under smeltetemperaturen, og dér er 14 % udfoldet, mens 77 °C ligger 10 grader over, og dér er 85 % udfoldet.

Opgaver i eksamensstil

Opgaverne ligner dem, du møder til den skriftlige prøve i kemi A. DNA er her rammen om spørgsmål i kernestoffet: termodynamik, ligevægt, intermolekylære bindinger og spektrofotometri.

Opgave A7.4.eks.1: En hårnål, der lyser

En hårnål af DNA kan bruges som en sonde, der viser, om en prøve indeholder en bestemt sekvens. I den ene ende af strengen sidder et farvestof, der kan udsende lys. I den anden ende sidder en gruppe, der slukker lyset, når de to ender er tæt på hinanden. En foldet hårnål er derfor mørk, mens en udfoldet hårnål lyser.

Den foldede og den udfoldede form af hårnålen er i ligevægt:

foldet hårnål ⇌ udfoldet hårnål

Ud fra lysets styrke er ligevægtskonstanten for udfoldningen bestemt ved seks temperaturer.

t i °C 45 50 55 60 65 70
K 0,0766 0,224 0,664 1,99 5,22 13,6
  1. Opskriv ligevægtsloven for udfoldningen af hårnålen, og argumentér ud fra tabellen for, at udfoldningen er endoterm.
  2. Bestem ΔH⊖ og ΔS⊖ for udfoldningen ved at afbilde ln K som funktion af 1/T.
  3. Bestem hårnålens smeltetemperatur, altså den temperatur, hvor halvdelen af hårnålene er udfoldet.
  4. Sonden skal bruges ved 37 °C. Beregn, hvor stor en del af hårnålene der er udfoldet ved 37 °C, og vurdér, om sonden er mørk ved 37 °C, når den er alene i opløsningen.

Se på, hvordan ligevægtskonstanten for udfoldningen af hårnålen ændrer sig, når temperaturen stiger, og brug reglen fra B-niveau: opvarmning forskyder en ligevægt i den endoterme retning. I spørgsmål b bruger du van ’t Hoff-ligningen fra afsnit A2.6. Regn hver temperatur om til kelvin, beregn 1/T og ln K i et regneark, og lav lineær regression. Besvarelsen skal have grafen med punkter og linje, modellen med symboler og enheder og en vurdering af, hvordan punkterne ligger.

For hårnålen er den første temperatur T = (273 + 45) K = 318 K, så 1/T = 3,145 · 10−3 K−1 og ln K = ln(0,0766) = −2,569. Hældningen bliver cirka −2,27 · 104 K. Brug ΔH⊖ = −a · R og ΔS⊖ = b · R.

Ved smeltetemperaturen er der lige meget foldet og udfoldet hårnål, så K = 1 og ΔG⊖ = 0. I spørgsmål d sætter du T = 310 K ind i modellen og finder K. x angiver her den del af hårnålene, der er udfoldet, og så er K = x / (1 − x).

Du kan begynde vurderingen af modellen sådan: “Punkterne ligger … linjen og fordeler sig … over og under den. Forklaringsgraden er …, så modellen …”

  1. Ligevægtsloven for udfoldningen af hårnålen er

\[ K = \frac{[\text{udfoldet}]}{[\text{foldet}]} \]

Tabellen viser, at ligevægtskonstanten vokser, når temperaturen stiger. Ligevægten forskydes altså mod højre ved opvarmning. Opvarmning forskyder en ligevægt i den endoterme retning, så udfoldningen er endoterm. Det passer med, at hydrogenbindingerne og londonbindingerne mellem baserne skal brydes, når hårnålen folder sig ud.

  1. Udtrykket, der skal undersøges

Van ’t Hoff-ligningen er

\[ \ln K = -\frac{\Delta H^{\ominus}}{R} \cdot \frac{1}{T} + \frac{\Delta S^{\ominus}}{R} \]

Afbildes ln K som funktion af 1/T, skal punkterne derfor ligge på en ret linje med hældningen −ΔH⊖ / R og skæringen ΔS⊖ / R. Temperaturerne regnes om til kelvin med T = (273 + t/°C) K, og 1/T og ln K beregnes for hver måling.

t i °C T i K K 1/T i K−1 ln K
45 318 0,0766 3,145 · 10−3 −2,569
50 323 0,224 3,096 · 10−3 −1,496
55 328 0,664 3,049 · 10−3 −0,409
60 333 1,99 3,003 · 10−3 0,688
65 338 5,22 2,959 · 10−3 1,652
70 343 13,6 2,915 · 10−3 2,610

Graf og regression

Figur 5: ln K for udfoldningen af hårnålen som funktion af 1/T med den bedste rette linje.

Lineær regression på de seks punkter giver modellen

\[ \ln K = -2{,}272 \cdot 10^{4}\ \mathrm{K} \cdot \frac{1}{T} + 68{,}87 \]

Her er y = ln K og x = 1/T. Hældningen er a = −2,272 · 104 K, og skæringen er b = 68,87. Tabellen viser afrundede tal. Taster du dem ind i stedet for at lade regnearket regne 1/T og ln K ud, kan de sidste cifre i modellen blive lidt anderledes.

Vurdering af modellen

Punkterne ligger tæt på linjen og fordeler sig tilfældigt over og under den. Forklaringsgraden er r2 = 0,9998. Modellen beskriver målingerne godt, og det passer med antagelsen om, at ΔH⊖ og ΔS⊖ ikke afhænger af temperaturen mellem 45 °C og 70 °C.

ΔH⊖ og ΔS⊖

\[ \Delta H^{\ominus} = -a \cdot R = -(-2{,}272 \cdot 10^{4}\ \mathrm{K}) \cdot 8{,}314\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}} = 1{,}889 \cdot 10^{5}\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol}} \]

\[ \Delta S^{\ominus} = b \cdot R = 68{,}87 \cdot 8{,}314\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}} = 572{,}6\ \dfrac{\mathrm{J}}{\mathrm{mol \cdot K}} \]

For udfoldningen af hårnålen er ΔH⊖ = 188,9 kJ/mol og ΔS⊖ = 572,6 J/(mol · K). ΔH⊖ er positiv, og det passer med, at linjen falder mod højre, og at der brydes bindinger. ΔS⊖ er positiv, og det passer med, at en udfoldet streng, der kan bøje og dreje sig, har mere uorden end en foldet hårnål.

  1. Ved smeltetemperaturen er halvdelen af hårnålene udfoldet. Så er [udfoldet] = [foldet], K = 1 og ln K = 0, og dermed er ΔG⊖ = 0:

\[ \Delta G^{\ominus} = \Delta H^{\ominus} - T_\mathrm{m} \cdot \Delta S^{\ominus} = 0 \]

ΔS⊖ regnes om: 572,6 J/(mol · K) = 0,5726 kJ/(mol · K).

\[ T_\mathrm{m} = \frac{\Delta H^{\ominus}}{\Delta S^{\ominus}} = \frac{188{,}9\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol}}}{0{,}5726\ \dfrac{\mathrm{kJ}}{\mathrm{mol \cdot K}}} = 330\ \mathrm{K} \]

Hårnålens smeltetemperatur er 330 K, og det svarer til 57 °C. Det passer med tabellen, hvor K er mindre end 1 ved 55 °C og større end 1 ved 60 °C.

  1. Temperaturen er T = (273 + 37) K = 310 K. Den sættes ind i modellen:

\[ \ln K = -2{,}272 \cdot 10^{4}\ \mathrm{K} \cdot \frac{1}{310\ \mathrm{K}} + 68{,}87 = -4{,}420 \]

\[ K = e^{-4{,}420} = 0{,}0120 \]

x angiver her den del af hårnålene, der er udfoldet. Så er delen 1 − x foldet, og ligevægtsloven giver

\[ K = \frac{x}{1 - x} \qquad\Rightarrow\qquad x = \frac{K}{1 + K} \]

\[ x = \frac{0{,}0120}{1 + 0{,}0120} = 0{,}012 \]

Ved 37 °C er 1,2 % af hårnålene udfoldet. Næsten alle hårnålene er altså foldet, så sonden er mørk ved 37 °C, når den er alene i opløsningen. Den lyser først, når noget får den til at folde sig ud. Beregningen ligger uden for det område, der er målt i, og den antager, at ΔH⊖ og ΔS⊖ også har de samme værdier ved 37 °C.

Opgave A7.4.eks.2: To primere

Når et stykke DNA skal kopieres i et reagensglas, bruges primere (se afsnit A7.5). En primer er en kort enkeltstreng af DNA på omkring 20 nucleotider, som binder sig til den komplementære sekvens på en lang enkeltstreng:

primer + lang enkeltstreng ⇌ dobbeltstreng

Figur 6 viser en primer, der sidder på den lange enkeltstreng.

Figur 6: Primer 1 bundet til den komplementære sekvens.

For korte stykker DNA på omkring 20 nucleotider bruges en tommelfingerregel for smeltetemperaturen:

\[ T_\mathrm{m} = 2\ \mathrm{°C} \cdot N_\mathrm{AT} + 4\ \mathrm{°C} \cdot N_\mathrm{GC} \]

Her er NAT antallet af A og T i primeren, og NGC er antallet af G og C. Tabellen viser sekvenserne for to primere.

Primer Sekvens
1 5′-ATGCTTAGCATTCAAGTGAC-3′
2 5′-GCACTGGCTCAGGATCAGTC-3′

Hver primer er blandet med sin komplementære streng i hver sin opløsning, og absorbansen ved 260 nm er målt, mens opløsningerne blev varmet op. Figur 7 viser de to smeltekurver.

Figur 7: Smeltekurver for primer 1 og primer 2, hver bundet til sin komplementære streng.
  1. Beregn smeltetemperaturen for hver af de to primere med tommelfingerreglen.
  2. Bestem smeltetemperaturen for hver af de to primere ud fra smeltekurverne, og vurdér, hvor godt tommelfingerreglen passer.
  3. Beregn antallet af hydrogenbindinger mellem hver primer og dens komplementære streng, og forklar ud fra bindingerne mellem baserne, hvorfor G og C tæller mere end A og T i tommelfingerreglen.
  4. Opskriv ligevægtsloven for bindingen af en primer til den lange enkeltstreng. Forklar, hvilken vej ligevægten forskydes, når temperaturen hæves, og når koncentrationen af primer gøres større.

Tæl, hvor mange gange hvert af de fire bogstaver står i primerens sekvens. Smeltetemperaturen aflæses på en smeltekurve dér, hvor absorbansen har nået halvdelen af sin stigning. Baseparrene og deres hydrogenbindinger står i afsnit A7.3.

Primer 1 har 6 A, 6 T, 4 G og 4 C. Begge smeltekurver går fra absorbansen 0,48 til 0,66, så halvdelen af stigningen er nået ved 0,57. Et basepar af A og T har 2 hydrogenbindinger, og et basepar af G og C har 3.

Du kan begynde forklaringen om tommelfingerreglen sådan: “Et basepar af G og C har … hydrogenbinding mere end et basepar af A og T. Det kræver derfor … energi at skille et basepar af G og C, og …”

Når primeren binder sig til den lange enkeltstreng, dannes der bindinger mellem baserne. Brug det til at afgøre, om reaktionen mod højre er exoterm eller endoterm.

Du kan begynde forklaringen om ligevægten sådan: “Reaktionen mod højre er …, fordi … Opvarmning forskyder en ligevægt i den … retning, altså mod … Når koncentrationen af primer bliver større, bliver reaktionsbrøken … end K, og reaktionen forløber mod …”

  1. Bogstaverne i de to sekvenser tælles.
Primer A T G C NAT NGC
1 6 6 4 4 12 8
2 4 4 6 6 8 12

For primer 1 giver tommelfingerreglen

\[ T_\mathrm{m} = 2\ \mathrm{°C} \cdot 12 + 4\ \mathrm{°C} \cdot 8 = 56\ \mathrm{°C} \]

For primer 2 giver tommelfingerreglen

\[ T_\mathrm{m} = 2\ \mathrm{°C} \cdot 8 + 4\ \mathrm{°C} \cdot 12 = 64\ \mathrm{°C} \]

  1. Begge smeltekurver stiger fra absorbansen 0,48 til 0,66. Halvdelen af stigningen er nået ved absorbansen

\[ A = 0{,}48 + \frac{0{,}66 - 0{,}48}{2} = 0{,}57 \]

Kurven for primer 1 når absorbansen 0,57 ved 54 °C, og kurven for primer 2 når den ved 65 °C, som Figur 8 viser.

Figur 8: Smeltetemperaturen for de to primere aflæses ved absorbansen 0,57.
Primer Tm efter tommelfingerreglen Tm aflæst på smeltekurven
1 56 °C 54 °C
2 64 °C 65 °C

Tommelfingerreglen rammer inden for 2 °C for begge primere, og den giver den rigtige rækkefølge. Den er altså god nok til et hurtigt skøn. Reglen tæller kun baserne. Den tager ikke hensyn til basernes rækkefølge, til mængden af salt eller til koncentrationen af primer, så en måling er mere præcis.

  1. Et basepar af A og T har 2 hydrogenbindinger, og et basepar af G og C har 3. For primer 1 er antallet af hydrogenbindinger

\[ \text{antal hydrogenbindinger} = 12 \cdot 2 + 8 \cdot 3 = 48 \]

For primer 2 er antallet af hydrogenbindinger

\[ \text{antal hydrogenbindinger} = 8 \cdot 2 + 12 \cdot 3 = 52 \]

Hver hydrogenbinding går fra et hydrogenatom, der sidder på et nitrogenatom i den ene base, til et oxygenatom eller et nitrogenatom med et ledigt elektronpar i den anden base. Et basepar af G og C har én hydrogenbinding mere end et basepar af A og T. Det kræver derfor mere energi at skille et basepar af G og C, og hvert G og C i primeren hæver smeltetemperaturen mere end et A eller et T. Derfor tæller G og C mest i tommelfingerreglen. Primer 2 har flest hydrogenbindinger, og den har også den højeste smeltetemperatur.

Tallene 2 °C og 4 °C følger ikke antallet af hydrogenbindinger helt: et basepar af G og C har 1,5 gange så mange hydrogenbindinger som et basepar af A og T, men tæller dobbelt. Stablingen af baseparrene med londonbindinger betyder også noget, og derfor er reglen kun en tommelfingerregel.

  1. Ligevægtsloven for bindingen af en primer til den lange enkeltstreng er

\[ K = \frac{[\text{dobbeltstreng}]}{[\text{primer}] \cdot [\text{lang enkeltstreng}]} \]

Der står M over brøkstregen og M · M under, så enheden er M−1.

Når primeren binder sig til den lange enkeltstreng, dannes der hydrogenbindinger mellem baserne og londonbindinger mellem de stablede basepar. Der afgives energi, så reaktionen mod højre er exoterm. Opvarmning forskyder en ligevægt i den endoterme retning, altså mod venstre. Når temperaturen hæves, slipper primeren derfor den lange enkeltstreng.

Når koncentrationen af primer gøres større, bliver nævneren i reaktionsbrøken større, og reaktionsbrøken bliver mindre end K. Reaktionen forløber mod højre, indtil reaktionsbrøken igen er lig med K. En større del af de lange enkeltstrenge får altså bundet en primer. Derfor afhænger smeltetemperaturen for korte stykker DNA også af koncentrationen.

Opgave A7.4.eks.3: Koncentrationen af DNA i en prøve

I et laboratorium skal koncentrationen af dobbeltstrenget DNA i en prøve bestemmes med et spektrofotometer. Baserne i DNA absorberer ultraviolet lys med bølgelængden 260 nm. Der fremstilles fem opløsninger af dobbeltstrenget DNA med kendte koncentrationer, og absorbansen måles ved 260 nm i en kuvette med lysvejen 1,00 cm.

c i µg/mL 5,0 10,0 20,0 30,0 40,0
A 0,104 0,196 0,405 0,601 0,793

Prøven er for koncentreret til at blive målt direkte. Derfor fortyndes 0,200 mL af prøven til 5,00 mL. Den fortyndede prøve har absorbansen 0,479 ved 260 nm.

  1. Opskriv Lambert-Beers lov, og forklar ud fra loven, hvorfor en graf over absorbansen som funktion af koncentrationen af DNA bør være en ret linje.
  2. Bestem en lineær model for absorbansen som funktion af koncentrationen af DNA.
  3. Bestem koncentrationen af DNA i prøven før fortyndingen.
  4. Den fortyndede prøve varmes til 95 °C i kuvetten, og absorbansen ved 260 nm stiger til 0,656. Forklar, hvorfor absorbansen stiger, og vurdér, om standardkurven kan bruges til en prøve, hvor DNA’et er enkeltstrenget.

Lambert-Beers lov står i afsnit B5.3, og standardkurven står i afsnit B5.4. Afbild absorbansen som funktion af koncentrationen af DNA i et regneark, og lav lineær regression uden at tvinge linjen gennem (0, 0). Besvarelsen skal have grafen med punkter og linje, modellen med symboler og enheder og en vurdering af, hvordan punkterne ligger.

Hældningen for standardkurven for DNA bliver cirka 0,0198 mL/µg, og skæringen bliver tæt på nul. Løs modellen for c, og sæt absorbansen 0,479 ind. Det giver koncentrationen i den fortyndede prøve. Prøven er fortyndet fra 0,200 mL til 5,00 mL, så du skal regne tilbage med fortyndingsformlen.

Ved 95 °C er DNA’et smeltet. Tænk på, hvad der sker med absorbansen ved 260 nm, når de to strenge i DNA skilles.

Du kan begynde vurderingen sådan: “Standardkurven er lavet med … DNA. Enkeltstrenget DNA absorberer … ved den samme koncentration, så standardkurven ville give en koncentration, der er …”

  1. Lambert-Beers lov er

\[ A = \varepsilon \cdot l \cdot c \]

A er absorbansen, ε er ekstinktionskoefficienten, \(l\) er lysvejen, og c er koncentrationen af det stof, der absorberer lyset. Alle opløsningerne af DNA måles ved 260 nm i den samme kuvette, så ε og \(l\) er de samme i alle målingerne. Absorbansen er derfor proportional med koncentrationen af DNA, og en graf over absorbansen som funktion af koncentrationen bør være en ret linje gennem (0, 0). Det gælder også, når koncentrationen står i µg/mL, fordi massen af DNA er proportional med stofmængden af nucleotider.

  1. Udtrykket, der skal undersøges

Ifølge Lambert-Beers lov er A = a · c, hvor a er en konstant. Absorbansen afbildes derfor som funktion af koncentrationen af DNA, og der laves lineær regression uden at tvinge linjen gennem (0, 0).

Graf og regression

Figur 9: Standardkurve for dobbeltstrenget DNA ved 260 nm med den bedste rette linje.

Lineær regression giver y = 0,0198 · x + 0,004. Med symboler og enheder er modellen

\[ A = 0{,}0198\ \dfrac{\mathrm{mL}}{\mathrm{\mu g}} \cdot c + 0{,}004 \]

Vurdering af modellen

Punkterne ligger tæt på linjen og fordeler sig tilfældigt over og under den. Forklaringsgraden er r2 = 0,9998. Skæringen 0,004 er meget tæt på nul, som Lambert-Beers lov siger, den skal være. Modellen beskriver målingerne godt og kan bruges som standardkurve for dobbeltstrenget DNA.

  1. Modellen løses for c, og absorbansen af den fortyndede prøve sættes ind:

\[ c_{\text{efter}} = \frac{A - 0{,}004}{0{,}0198\ \dfrac{\mathrm{mL}}{\mathrm{\mu g}}} = \frac{0{,}479 - 0{,}004}{0{,}0198\ \dfrac{\mathrm{mL}}{\mathrm{\mu g}}} = 24{,}0\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Absorbansen 0,479 ligger mellem den laveste og den højeste standardopløsning, så standardkurven kan bruges. Fortyndingsformlen giver koncentrationen før fortyndingen:

\[ c_{\text{før}} = \frac{c_{\text{efter}} \cdot V_{\text{efter}}}{V_{\text{før}}} = \frac{24{,}0\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \cdot 5{,}00\ \mathrm{mL}}{0{,}200\ \mathrm{mL}} = 600\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Prøven indeholder 600 µg DNA pr. mL før fortyndingen, altså 0,600 mg/mL.

  1. Ved 95 °C er temperaturen over smeltetemperaturen, så de to strenge i DNA’et er skilt. I dobbeltspiralen ligger baserne stablet, og stablede baser absorberer mindre lys ved 260 nm end frie baser. Når strengene skilles, absorberer baserne derfor mere lys. Forholdet mellem absorbansen efter og før opvarmningen er

\[ \text{forhold} = \frac{0{,}656}{0{,}479} = 1{,}37 \]

Absorbansen bliver 1,37 gange så stor. Det er en stigning på 37 %, og det er den stigning, afsnit A7.4 nævner for DNA, der smelter. Koncentrationen af DNA i kuvetten er den samme før og efter opvarmningen.

Standardkurven er lavet med dobbeltstrenget DNA. Sættes absorbansen 0,656 ind i modellen, giver den

\[ c = \frac{0{,}656 - 0{,}004}{0{,}0198\ \dfrac{\mathrm{mL}}{\mathrm{\mu g}}} = 32{,}9\ \dfrac{\mathrm{\mu g}}{\mathrm{mL}} \]

Den rigtige koncentration er 24,0 µg/mL, så resultatet er 37 % for højt. Standardkurven kan altså ikke bruges til en prøve med enkeltstrenget DNA. Skal sådan en prøve måles, skal standardopløsningerne også indeholde enkeltstrenget DNA.