A7.5 PCR: kopiering i et reagensglas

Supplerende stof

Kapitel A7 er et temakapitel og ligger uden for kernestoffet. Dette afsnit bruger enzymer fra afsnit A6.1, nucleofil og udgående gruppe fra afsnit A5.6 og smeltning af DNA fra afsnit A7.4.

Det skal du kunne

beskrive den reaktion, enzymet DNA-polymerase katalyserer
forklare de tre trin i en PCR-cyklus ud fra temperaturen
forklare, hvorfor enzymet i PCR skal kunne tåle varme
beregne antallet af kopier efter et antal cyklusser
forklare, hvad en primer er, og hvorfor den er nødvendig

Et spor på et gerningssted kan indeholde DNA fra nogle få celler. En podepind fra halsen kan indeholde nogle få viruspartikler. Det er alt for lidt til at måle på. Med metoden PCR kan man på et par timer lave en milliard kopier af et bestemt stykke DNA, og så er der nok. Metoden bygger på to ting fra de foregående afsnit: baseparring og smeltning.

Enzymet, der bygger DNA

Cellen kopierer sit DNA med et enzym, der hedder DNA-polymerase. Enzymet kan ikke begynde på bar bund. Det skal have tre ting:

en skabelonstreng, som det kan aflæse
en kort streng, der allerede sidder på skabelonen og ender med en fri OH-gruppe på carbonatom 3′
nucleotider med tre phosphatgrupper i stedet for én

Figur 1: DNA-polymerase sætter ét nucleotid på ad gangen.

Enzymet vælger det nucleotid, der passer til den næste base i skabelonen: G over for C, og A over for T. Så sker selve reaktionen:

OH-gruppen i 3′-enden er nucleofilen. Dens ledige elektronpar angriber phosphoratomet i den inderste phosphatgruppe.
De to yderste phosphatgrupper er den udgående gruppe. De forlader molekylet samlet som en diphosphation.

Det er de samme roller som i afsnit A5.6, blot er det et phosphoratom og ikke et carbonatom, der bliver angrebet. I enzymets aktive center sidder to magnesiumioner, Mg²⁺, som holder på de negativt ladede phosphatgrupper og gør phosphoratomet mere elektrofilt.

Resultatet er en ny phosphodiesterbinding og en streng, der er ét nucleotid længere og igen ender med en fri OH-gruppe. Strengen vokser derfor altid i 3′-enden.

Tre temperaturer

I PCR lader man DNA-polymerase kopiere det samme stykke DNA igen og igen. Reagensglasset indeholder prøven med DNA, enzymet, de fire nucleotider og to slags primere. En primer er en kort enkeltstreng på omkring 20 nucleotider, som er komplementær til begyndelsen af det stykke, man vil kopiere. Det er primerne, der bestemmer, hvilket stykke der bliver kopieret, og det er deres 3′-ende, enzymet bygger videre på.

Et PCR-apparat gør ikke andet end at skifte temperatur.

Figur 2: Temperaturen gennem én PCR-cyklus.

Trin	Temperatur	Det sker
1	95 °C	Temperaturen er over smeltetemperaturen. Dobbeltstrengene skilles til enkeltstrenge.
2	omkring 55 °C	Temperaturen er under primernes smeltetemperatur. Primerne binder sig til de steder på enkeltstrengene, hvor de passer.
3	72 °C	DNA-polymerase bygger videre fra primerne og laver hver enkeltstreng om til en dobbeltstreng.

Trin 1 og 2 er ligevægten fra afsnit A7.4, som temperaturen skubber først den ene og så den anden vej. De korte primere finder deres plads længe før de lange strenge finder hinanden igen, fordi der er rigtig mange primere i glasset.

Et enzym, der tåler 95 °C

De fleste enzymer denaturerer, længe før temperaturen når 95 °C, som du så i afsnit A6.1. En almindelig DNA-polymerase ville være ødelagt efter første cyklus. I PCR bruges derfor et enzym fra en bakterie, der lever i varme kilder. Dens proteiner er holdt sammen af ekstra mange bindinger mellem sidekæderne, og enzymet arbejder bedst ved 72 °C og tåler 95 °C.

Fordobling

Efter én cyklus er hvert DNA-molekyle blevet til to. I næste cyklus bliver begge kopieret.

Figur 3: Antallet af kopier fordobles i hver cyklus.

Begynder man med N₀ molekyler, er der efter n cyklusser

\[ N = N_0 \cdot 2^{n} \]

Eksempel: fra 50 molekyler til en milliard

En prøve indeholder 50 DNA-molekyler. Beregn antallet efter 30 cyklusser, og beregn, hvor mange cyklusser der skal til for at nå 1,0 · 10⁹ molekyler.

Efter 30 cyklusser

\[ N = 50 \cdot 2^{30} = 5{,}4 \cdot 10^{10} \]

Antal cyklusser

Ligningen N = 50 · 2ⁿ med N = 1,0 · 10⁹ løses for n:

\[ n = \frac{\log\left( \dfrac{1{,}0 \cdot 10^{9}}{50} \right)}{\log 2} = 24{,}3 \]

Konklusion

Efter 30 cyklusser er der 5,4 · 10¹⁰ molekyler. En milliard nås i løbet af den 25. cyklus.

I virkeligheden går fordoblingen i stå efter 30 til 40 cyklusser, fordi primere og nucleotider bliver brugt op.

Hvad bruges PCR til?

Test for virus. Primerne vælges, så de kun passer på virusets arvemateriale. Bliver der dannet kopier, var viruset i prøven. Jo færre cyklusser der skal til, før kopierne kan måles, jo mere virus var der fra start.
Kriminalteknik. Bestemte steder i DNA har forskellig længde fra person til person. Stykkerne kopieres med PCR og sorteres efter længde med gelelektroforese fra afsnit A7.2. Mønsteret kaldes en DNA-profil.
Arvelige sygdomme. Et gen kan kopieres og undersøges for ændringer i sekvensen.

Til den skriftlige prøve

Skal du forklare en reaktion mellem to store molekyler, så find den gruppe, der har et ledigt elektronpar, og den gruppe, der forlader molekylet.
Skal du forklare, hvorfor et enzym virker ved én temperatur og ikke ved en anden, så brug bindingerne mellem sidekæderne og ordet denaturere.
En fordobling for hvert trin er eksponentiel vækst. Antallet af trin findes med logaritmer.

Kort sagt

DNA-polymerase sætter nucleotider på 3′-enden af en streng, som sidder på en skabelonstreng.
OH-gruppen i 3′-enden er nucleofilen, og en diphosphation er den udgående gruppe.
En PCR-cyklus har tre trin: 95 °C skiller strengene, omkring 55 °C lader primerne binde, og ved 72 °C bygger enzymet nye strenge.
Enzymet kommer fra en bakterie fra varme kilder og tåler 95 °C.
Antallet af kopier fordobles i hver cyklus: N = N₀ · 2ⁿ.

Se alle opgaver til emnet “PCR: kopiering i et reagensglas” (A7.5)